本发明专利技术公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。该方法包括如下步骤：首先将小鼠类固醇生成因子-1基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1重组，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，经人胚肾细胞AD-293包装后得到腺病毒；再将该腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。经过本发明专利技术所述方法的诱导，人脐带间充质干细胞在体外可以分化为睾丸间质细胞，需时仅为1周，从而为采用细胞替代或者基因方法治疗睾酮缺乏症提供了重要的细胞来源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为诱导干细胞分化的生物
，特别涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。
技术介绍
随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症(PADAM)患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法(ART)，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用雄激素副作用较大，其一体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的雄激素分泌和生精功能。近年来随着细胞移植疗法的发展，人们把目光转向了采用睾丸间质细胞(Leydig cells)的移植。由于睾丸间质细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95%，人们试图通过睾丸间质细胞的移植来治疗睾酮分泌不足的问题，睾丸间质细胞移植可以升高患者血清睾酮水平。采用将分离提纯的睾丸间质细胞微囊化的方法，既可以防止宿主对植入睾丸间质细胞的免疫排异反应，又保证微胶囊内睾丸间质细胞成活和睾酮分泌，微囊化后睾丸间质细胞能对人绒毛膜促性腺激素有良好的反应性，术后能在一定时间内保持患者血清睾酮水平。 以上研究说明睾丸间质细胞移植可能是一种有效的治疗男性雄激素部分缺乏症的方法，但目前尚无法解决移植细胞来源的问题。间充质干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下，间充质干细胞能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。向骨髓间充质干细胞中转入类固醇生成因子-1 (SF-I)基因，能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞。但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体的年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的减弱甚至丧失；并且，骨髓间充质干细胞的分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找其他来源的干细胞和有效的诱导分化方法，可以更高效地将干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。本专利技术的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤(1)将SF-I基因(NM 139051，核苷酸序列171-1828，如SEQ ID NO. 1所示)插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι ； 然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌 BJ5183，得到携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι ；将腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD-293后得到腺病毒。(2)采用MOI = 200的量，将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞；诱导培养液的组成为基础培养基为DMEM/F12，含有体积百分比10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、 100 μ g/ml链霉素、500 μ M 二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)。步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化是采用I^c I酶切进行线性化；步骤(1)中所述的转染采用磷酸钙共沉淀法进行；步骤O)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到从正常的足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织(Wharton’ s jelly)，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80 90%融合时，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子可用FACScan流式细胞仪检测， 人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式细胞的鉴定条件为细胞的密度不低于 IO6 细胞/ml，采用 mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC 作为同型对照；采用成脂分化、成骨分化和成软骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用碱性磷酸酶(ALP)染色及Von kossa染色鉴定，成软骨分化用亚甲基蓝染色鉴定。步骤O)中所述的诱导分化的条件采用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5 X IO5个细胞/孔的密度接种到6孔板，在培养箱培养过夜让细胞贴壁后，更换为诱导培养液，以MOI = 200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻摇动培养板使病毒分布均勻，然后每两天更换新鲜诱导培养液，诱导分化的时间为7天。上述的方法应用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。一种睾丸间质细胞，通过上述方法得到。一种睾酮，通过上述睾丸间质细胞分泌得到。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)人脐带沃顿胶组织(Wharton's jelly)来源的间充质干细胞取自免疫系统尚未发育完善胎儿的脐带，具有增殖效率高，免疫原性低，在无免疫抑制的情况下不会出现免疫排斥。而骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体年衰或疾病的影响，逐渐不同程度的减弱甚至丧失。脐带来源间充质干细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，而且增殖能力更强，因此脐带间充质干细胞可以成为干细胞治疗中细胞移植的良好的细胞来源。(2)本专利技术所述的方法利用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，并在DMEM-F12培养液中添加dbcAMP，整个分化时间短，仅需一周即可获得睾丸间质细胞，具有更高的分化效率，能够获得更强睾酮分泌能力的睾丸间质细胞。本专利技术是一种高效地将间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，可为治疗男性雄激素部分缺乏症提供稳定的移植细胞的来源。附图说明图1是人脐带间质干细胞原代与培养5代图；图(a)为原代细胞，图(b)为培养5代的细胞，观察倍数均为100倍。图2是人脐带间充质干细胞的流式细胞术鉴定图。图3是ALP染色鉴定人脐带间充质干细胞的成骨分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天成骨诱导分化后的碱性磷酸酶(ALP)染色图，图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图4是Von Kossa染色鉴定人脐带间充质干细胞的成骨分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天成骨诱导分化后的Von kossa染色图，图 (b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图5是油红染色鉴定人脐带间充质干细胞的成脂分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天成脂诱导分化后的油红染色图，图(b)为未分化的人脐带间充本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏星，彭公峰，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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