用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法技术

本发明专利技术涉及用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法。本发明专利技术提供了一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于制备感受态细胞的细胞，且特别涉及一种具备在细胞内自发性累积自体产生的(self-producing)海藻糖能力的细胞，以及以此细胞来制备感受态细胞的方法。
技术介绍
使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程即所谓的“转化 (transformation) ”。而宿主细胞经过物理或化学方式处理而因此具有容易让DNA分子进入胞内的特性，即称为“感受态细胞(competent cell)”。在分子生物学领域及遗传工程操作上，为了使宿主细胞进行特定DNA或蛋白质的复制或表达，获得具有易于转化的感受态细胞，即成了重要而不可或缺的步骤。由于大肠杆菌(Escherichia coli)具有生长快速、容易培养与研究较透彻等优势，目前已成为所有生物技术相关实验中最广泛地用作宿主细胞的微生物。在近代遗传工程技术演进的历程上，已有许多制备具转化能力的大肠杆菌感受态细胞的方法及转化程序，例如，最早 1970 年 Mandel，M.和 Higa A. (J. Mol. Biol. 53 159)发表的 CaCl2 化学转化法，以及之后 1983 年 Hanahan，D. (J. Mol. Biol. 166 :557)禾Π 1990 年 Inoue，H. (Gene 96 23)相继通过在转化试剂中加入其它不同浓度的阳离子和抗冻剂进行改良。而目前较佳的转化效率已可达约IO8转化子/微克质粒DNA(transformants/ μ g plasmid DNA)。而根据上述制备具转化能力的大肠杆菌感受态细胞的方法所产生的感受态细胞， 其后续所需的储藏温度仍皆需为-70至-80°C左右，才能使感受态细胞在保存数月后转化效率不至于明显降低。近几年美国Life Technologies公司研发出一种对温度相对稳定型的感受态细胞的相关技术(美国专利号7，648，83 ，其突破传统上感受态细胞必需保存于-70至-80°C 左右的低温才能维持稳定转化效率的限制。该实施方式是在制备和保存感受态细胞的试剂中添加特定糖类或化学聚合物分子作为抗冻保护剂，因而可将制备完成的感受态细胞置于较高温度(例如-20°C )保存，且又不会明显降低原有的转化效率。前述技术虽然在保存条件的要求上较先前传统制备方法节能及方便运送，然而额外添加的特定抗冻保护剂相对地也提高了制备上的成本。因此目前亟需开发出一种应用于感受态细胞的制备的新颖物件及方法，使因此产生的感受态细胞可于较高温进行保存并同时达到节能、低成本与易于运送等优点，进而使生物细胞的基因转化技术的实施更为简易且经济。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。本专利技术另外提供一种将具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的细胞用于制备感受态细胞的用途。本专利技术还提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)，命名为大肠杆菌EcDTreOOl， 其保藏于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC No. 910491，其中该大肠杆菌具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力。所述大肠杆菌(命名为大肠杆菌(Escherichia coli)EcDTreOOl)也于2010年11 月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，Inhoffenstr. 7B, D-38124 不伦瑞克)，保藏号为 DSM 24175。本专利技术还提供一种将上述大肠杆菌用于制备感受态细胞的用途。本专利技术又提供一种制备感受态细胞的方法，包括培养上述用于制备感受态细胞的细胞以获得细胞悬浮液；将该细胞悬浮液置于冰浴中；离心该细胞悬浮液以获得细胞沉淀；混合转化试剂和该细胞沉淀；以及获得感受态细胞悬浮液。为了让本专利技术的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举优选具体实施方案，并配合所附图式，详细说明如下附图说明图1为曲线图，其显示WT和TG两种感受态细胞悬浮液在以_20°C保存6个月间的转化效率的稳定度差异。图2为长条图，其显示WT(a)、TG(a)、WT(b)和TG(b)四种感受态细胞悬浮液以-80°C及-20°C保存6个月间的转化效率的稳定度差异。图3A显示，在实施例3中形成WT-B和TG-B组的感受态细胞悬浮液的过程。图;3B为长条图，其显示WT、WT_B、TG和TG-B四组感受态细胞悬浮液在以_20°C保存6个月后的转化效率的差异。主要组件符号说明301 -、铝珠；303 -、感受态细胞悬浮液；305 -、试管；307 -、感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物309 -、质粒；311 - W水浴；313 -、热休克；315 -、琼脂培养基。具体实施例方式在本专利技术中，本专利技术提供一种具备在细胞内自发性累积自体产生的 (self-producing)海藻糖(trehalose)的能力的细胞，并将此细胞用于感受态细胞的制备。在细胞内累积的海藻糖可帮助细胞内蛋白质避免因低温造成的变性与聚集，同时也具有稳定细胞膜的功能。因此，由本专利技术细胞所制备出的感受态细胞，相对于先前技术具有可在相对于较高温且不需外加特定糖类或化学聚合物分子为抗冻剂的环境中进行保存等优点，且具有高转化效率。另外此处使用的措辞“自体产生的海藻糖”是指细胞内(within a cell)所产生的海藻糖，而非额外添加于细胞培养基的海藻糖。上述本专利技术的细胞可通过对微生物进行随机突变筛选或遗传工程改造而获得，但不限于此。微生物可包括，但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌或霉菌。大肠杆菌可包括，但不限于 DH5 α、JM109、XL1-Blue、HBlOl 或 BL21 等。在一个具体实施方案中，本专利技术的细胞通过对微生物进行遗传工程改造而获得。 上述遗传工程改造可包括使微生物过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因、 和/或敲除微生物基因组中至少一个内源性编码海藻糖分解相关酶的基因、和/或将至少一个编码外源性海藻糖合成相关酶的基因引入微生物的基因组中。在一个具体实施方案中，使微生物过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因是通过将至少一个与目标微生物基因组中的特定基因的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列插入目标微生物中实现的。通过一般重组技术可实现上述微生物遗传工程改造(参见，例如Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press·)。在一个具体实施方案中，微生物遗传工程改造可以下述方法来进行。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)从与目标微生物同种的细胞获得上述至少一个编码海藻糖合成相关酶的基因的核苷酸序列，和/或通过聚合酶链式反应从一种与目标微生物不同种的细胞获得上述至少一个编码海藻糖合成相关酶的基因的核苷酸序列。待获得的酶基因的信息可从例如GenBank检索。若需要的话，可根据所使用的目标微生物的不同，将所获得的序列进行编码最佳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉宏，蔡孟吟，洪婷婷，邓克立，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：