一种原位检测线粒体DNA片段整合到核基因组中的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法。该方法能够度线粒体DNA整合到核基因组中进行原位检测，特异性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法。
技术介绍
线粒体是具有双层膜结构的半自主性细胞器，能够独立进行基因的转录、翻译和蛋白质的表达，在细胞的能量代谢、自由基的产生和细胞凋亡等过程中都发挥着重要作用。 与核基因组相比，线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)缺乏组蛋白保护，而且没有有效的损伤修复系统，因此极易受到攻击，是致癌物作用的重要靶点。mtDNA的损伤包括突变、整合和不稳定性改变。线粒体受到损伤后，mtDNA可在短期内裂解，而且由于细胞内核酸降解酶活性下降不能有效清除，因此产生大量游离的mtDNA。另一方面，胞质中的mtRNA经逆转录也可生成 mtDNA。这些mtDNA通过细胞核膜的核孔进入核内，随机整合到核基因组中。如果这种整合出现在癌基因或抑癌基因上，便可诱导细胞发生癌变。已在多种人类肿瘤如肺癌、肝癌、 肾癌、乳腺癌中检测到了这种改变。例如，在HelaTG细胞中，发现mtDNA细胞色素C氧化酶 (COX)亚单位整合入C-myc基因内，产生了含有C-myc和COX融合遗传信息的mtRNA。因而 mtDNA与核内DNA(nDNA)的整合可能是肿瘤发生的重要基础。因此，检测线粒体DNA整合到核基因组中的状况能反映出线粒体的遗传损伤，对于评价基因组的稳定性具有重要的意义。目前原位检测线粒体基因组的方法是采用末端转移(Nick translation)的方法对靶向全长的线粒体DNA序列进行原位杂交。但是由于线粒体DNA整合到核基因组中具有随机性，并非是全长的线粒体基因整合进入核基因组，因而需要较短的探针采用更加灵敏的方式来检测线粒体基因整合到核基因组中的状况。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA 与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。目前，FISH技术已经广泛应用于动植物及微生物的研究中，成为生物学和医学研究的重要技术手段。目前FISH技术主要是针对细胞核DNA进行的。例如在肿瘤学研究和临床中采用 FISH技术检测位于染色体17qll. 2_ql2的HER-2基因的扩增情况，可用于指导临床上赫赛汀(Here印tin)的用药；EGFR基因扩增情况可用于指导分子靶向药物吉非替尼的用药。针对核基因组DNA的染色质原位杂交采用的荧光探针一般较长，以保证寡核苷酸探针的特异性，商品化的荧光探针长达400KB。而线粒体DNA的总长度仅有20KD，而由于双链断裂而整合进入细胞核DNA中的片段常常更短。因而需要在检测较短DNA片段的时候提高杂交的特异性。并且由于细胞的细胞质中均有几十至数百个线粒体基因组的拷贝，细胞质中的线粒体DNA会与荧光探针杂交而形成较强的杂交信号，因而需要提高细胞核内荧光探针与整合到基因组中mtDNA的杂交信号。目前还未曾见用于线粒体DNA的检测。因此，提供一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法，具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法。该方法能够对线粒体DNA整合到核基因组中进行原位检测，特异性好。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案本专利技术提供了一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法，包括如下步骤获得组织切片，经预处理后获得第一切片；设计长度为50 70bp的探针并用荧光素标记；所述探针序列与所述线粒体DNA 序列互补；取无关DNA与所述第一切片混合后获得第二切片；取所述探针与所述第二切片混合，杂交、复染，荧光显微检测；所述无关DNA与所述线粒体DNA不结合。细胞中有些物质(比如某些蛋白质)会吸附DNA(比如有些细胞中的DNA结合蛋白，对任何DNA都有亲和力)，这样如果带有荧光的DNA与之非特异性结合，观察到荧光点， 会有假阳性结果出现，但是这并非是探针和匹配的DNA结合所致，因此，为了消除此类非特异性的结合，加入一些无关的DNA，让其去结合那些容易结合DNA的物质，减小DNA探针与那些容易结合DNA的物质结合的几率，增大DNA探针结合靶序列DNA的几率，探针结合就会更具有特异性。对细胞中线粒体DNA整合到核基因组中进行原位检测，可以同时结合蛋白质免疫荧光实验等，有助于检测线粒体基因组整合过程中的相关蛋白(比如同时采用红色荧光罗丹明标记的二抗进行免疫荧光实验，如果红色和绿色重合后成为黄色，则说明某种蛋白与线粒体整合是共定位的，二者可能功能上相关)。因此，先加入无关的DNA，可以结合在某些易于吸附DNA的地方；再加入探针DNA， 则可减少或消除探针DNA的非特异性结合。探针长度小于50bp杂交的特异性难以得到保证；大于70bp后，短片段的整合难以检测出(假阴性)。探针的序列可根据线粒体序列进行设计，只要满足探针序列与线粒体DNA序列互补即可，无关DNA序列亦根据线粒体序列进行设计，只要满足无关DNA与线粒体DNA不结合即可。本专利技术提供的探针序列、无关DNA序列并不限制本专利技术。原位检测小鼠线粒体DNA整合到核基因组时，探针序列如SEQ ID NO :1所示，无关 DNA序列如SEQ ID NO 2所示。原位检测大鼠线粒体DNA整合到核基因组时，探针序列如SEQ ID NO :3所示，无关 DNA序列如SEQ ID NO 2所示。作为优选，杂交为在65 85°C杂交5min，置于40 45°C杂交10 14h。作为优选，所述荧光素包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)、四乙基罗丹明(RB200)、量子点(quantum dot)、Cy3或Cy5中的一种或两者以上的混合物。作为优选，预处理包括除蛋白、除RNA的步骤。在细胞中，DNA不是裸露的，上面有RNA、蛋白质等等结合，采用RNAse，蛋白酶等处理样品，能更好的使DNA暴露出来，降低背景(噪音)、以及假阳性。优选地，预处理具体为采用终浓度为100 300 μ g/ml的蛋白酶K，35 40°C下孵育15 45min，采用终浓度为50 200 μ g/ml的RNAse，37°C下孵育15min。优选地，所述预处理还包括取采用终浓度为0. 2mol/L的NaCl溶液，60°C处理Ih 的步骤。作为优选，所述预处理还包括在15 35 °C下于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次 5min ；甲醛固定IOmin ；依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2min，自然干燥的步马聚ο本专利技术提供一种原位检测线粒体DNA整合到核基因组中的方法。该方法能够度线粒体DNA整合到核基因组中进行原位检测，特异性好。附图说明图1示实施例1荧光原位杂交检测结果；其中，图1㈧示正常小鼠小肠组织线粒体DNA探针杂交检测结果；图I(B)示正常小鼠小肠组织DAPI染细胞核结果；图I(C)示正常小鼠小肠组织线粒体DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒羽，童建，曹建平，曹毅，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：