本发明专利技术公开了一种烟草黑胫病病菌液固复合体系培养方法及培养物应用，该法培养获得的固体物可用于烟草黑胫病的人工接种物，也可用于制备带烟草黑胫病病菌病土的添加物，以便测定烟草品种对黑胫病的抗感性、筛选防治烟草黑胫病的药剂或生防菌、天然产物。其培养步骤包括（A）病菌分离，从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌；（B）平板培养，将病菌接种于培养基平板上，24~30℃下培养5~7天；（C）液体培养，将平板菌丝接种于培养液中，24~30℃、150转/分钟振荡培养5~7天；（D）固体培养，将液体菌丝接种于固体培养基，24~30℃培养8~12天。本发明专利技术具有接种量大、培养周期短、不易污染等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物发酵工程
，具体涉及一种烟草黑胫病病菌液固复合体系培养方法及培养物的应用。
技术介绍
烟草黑胫病(tobacco black shank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一， 特别是在温带、亚热带和热带发生较重，也是我国烟草生产的主要病害类型。目前，在实验室、温室有采用平板菌丝块、搅碎菌丝液、游动孢子液等制备烟草黑胫病病菌接种体的方法。这几类方法制备的接种体操作复杂、技术难度大，一般不适用于大田人工接种。在田间烟草黑胫病病菌接种体应用较多的是谷物培养接种体，主要供烟草种质资源抗性鉴定或药剂筛选时人工接种病原物用。这种谷物培养是将平板上的菌丝块直接接种到谷物培养基表面，让菌丝由内向四周、由上向下生长、蔓延。由于是单点或几点表层接种， 菌丝通常需要45飞0天才可能长满整个基质，周期较长；培养时上下层菌丝生长不同步，导致上部菌丝过度老熟、而下部菌丝过于幼嫩，固体培养物不均一，影响病菌的侵染，造成极大人为误差；而且培养时病菌菌丝不能很快占领基质而为其他可能污染的杂菌提供了生长的机会，导致病菌培养的杂菌污染，培养病菌失败。此外，谷物培养接种体的谷粒过大，大量过剩的营养物为其潜在的拮抗微生物提供了丰富的养料，致使拮抗微生物迅速繁殖，而病菌接种体的有效数量急剧下降，不能形成有效浸染。因此，如何有效地固体培养烟草黑胫病病菌是烟草育种、植保工作中值得探索的技术问题。
技术实现思路
下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制， 基于本专利技术教导所作的任何变更或改进，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第一目的是通过以下技术方案来实现的，包括病菌分离、平板培养、液体培养、固体培养，具体包括以下步骤A、病菌分离，从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌，将菌种采用菌丝块水浸法置于10°C条件下恒温保存，备用；B、平板培养，将病菌接种于培养基平板上，于M 30°C温度下培养5 7天，选择菌丝纯白色，在平板表面密布一层菌丝的培养物，用作液体培养菌种；C、液体培养，将B步骤得到的平板菌丝接种于培养液中，于M 30°C温度下，13(Tl50r/ min转速下振荡培养5 7天，培养得到的液体菌液中菌丝白色、菌液不浑浊、菌丝不成团，镜检可发现游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1万个以上；D、固体培养，将C步骤得到的液体菌丝接种于固体培养基，2Γ30 培养8 12天，培养得到的固体培养物整个基质布满白色菌丝，菌丝经过液体浸泡、低温诱导、室温释放孢子， 镜检可见游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10万个以上。本专利技术的另一目的是这样实现的，培养物用于烟草黑胫病的人工接种物，或者用于制备带烟草黑胫病病菌病土的添加物。本专利技术相对于现有技术，具有以下优点及效果(1)培养质量稳定。本专利技术通过增加液体培养步骤来增大固体培养的接种量，能使病菌迅速占领基质，达到同步、快速生长，生长周期短，比常规缩短培养时间1(Γ15天，在严格无菌操作的前提下，可杜绝杂菌污染；通过严密控制培养的每一个流程，从而形成科学完整的质量保障措施；而且每一个流程时间控制范围窄，可合理安排培养时间，保障病菌培养质量的时效性；(2)培养病菌的有效侵染数量大。培养所用的颗粒比通常用的谷粒小3飞倍，病菌能占据整粒基质，过剩的营养物质少，这样既能促进病菌的继续繁殖，又能避免潜在拮抗微生物的生长、使病菌免于消解，病菌的有效侵染数量大。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制， 基于本专利技术教导所作的任何变更或改进，均属于本专利技术的保护范围。包括病菌分离、平板培养、液体培养、固体培养，具体包括以下步骤Α、病菌分离，从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌，将菌种采用菌丝块水浸法置于10°C条件下恒温保存，备用；B、平板培养，将病菌接种于培养基平板上，于M 30°C温度下培养5 7天，选择菌丝纯白色，在平板表面密布一层菌丝的培养物，用作液体培养菌种；C、液体培养，将B步骤得到的平板菌丝接种于培养液中，于M 30°C温度下，13(Tl50r/ min转速下振荡培养5 7天，培养得到的液体菌液中菌丝白色、菌液不浑浊、菌丝不成团，镜检可发现游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1万个以上；D、固体培养，将C步骤得到的液体菌丝接种于固体培养基，2Γ30 培养8 12天，培养得到的固体培养物整个基质布满白色菌丝，菌丝经过液体浸泡、低温诱导、室温释放孢子， 镜检可见游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10万个以上。所述的B步骤培养基为燕麦、芝麻、黑麦、白芸豆、利马豆、大豆培养基中的任意一种。所述的C步骤培养液为2(T30g的燕麦、芝麻、黑麦、白芸豆、利马豆、大豆中任意一种，加入IOOOmL蒸馏水中浸泡1818小时后，将组织捣碎后过滤，常规湿热方法灭菌，再加入用l(T20g 6 7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、过滤灭菌制备的烟根组织液混勻即成，所述培养液占容器容积的309Γ50%。所述的C步骤培养液为15(T250g新鲜胡萝卜、番茄、大豆芽、绿豆芽中的任意一种，加入IOOOmL馏水，将组织捣碎后过滤，再依次经过0. 45 μ m、0. 22 μ m滤膜过滤后灭菌； 再加入用l(T20g 6 7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、过滤灭菌制备的烟根组织液混勻即成，所述培养液占容器容积的309Γ50%。所述的C步骤平板菌丝接种于培养液是用灭菌的解剖刀切取烟草黑胫病病菌菌丝块，菌丝块大小为2、X 2 4mm，固体培养基载体厚度为广2mm，每100毫升培养液接种菌丝2 4块。所述的D步骤固体培养基为粒径广3mm的粗米糠或粉碎豌豆杆或蚕豆杆中的一种或一种以上，与粗麦麸以3 4:广2的质量比混勻，加入409Γ50%的水充分混勻，固体培养基占容器容积的50% 80%，常规湿热灭菌。所述的D步骤固体培养基为粒径广3mm的新鲜豆腐渣和粗麦麸以6 8:广2的质量比混勻，加水混合控制含水量为409Γ50%，固体培养基占容器容积的509Γ80%，常规湿热灭菌。所述的D步骤液体菌丝接种于固体培养基系按39Γ5%的体积比加入，加入后培养基底部无积液。实施例1将从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌，将菌种采用菌丝块水浸法置于10°c条件下恒温保存，备用；将病菌接种于培养基为IOg燕麦在IOOOmL蒸馏水中浸泡M小时后，将组织捣碎后过滤，常规湿热方法灭菌，再加入用IOg 6 7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、过滤灭菌制备的烟根组织液混勻，并制成培养基板，于温度下培养5天，选择菌丝纯白色，在平板表面密布一层菌丝的培养物，用作液体培养菌种；再将得到的平板菌丝接种于以150g新鲜胡萝卜加入IOOOmL馏水将组织捣碎后过滤，再依次经过 0. 45 μ m、0. 22 μ m滤膜过滤后灭菌；再加入用IOg 6^7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、 过滤灭菌制备的烟根组织液混勻即成培养液中，平板菌丝接种于培养液是用灭菌解剖刀切取烟草黑胫病病菌菌丝块，菌丝块大小为4X4mm，固体培养基载体厚度为1. 9mm，每100毫升培养液接种菌丝2块。接种后于温度下，130r/m本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方敦煌，卢秀萍，肖炳光，宋春满，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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