本发明专利技术提供了含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用。所述转基因表达载体包括：5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。本发明专利技术还提供了该叶绿体转基因表达载体的构建方法。本发明专利技术进一步提供了该叶绿体转基因表达载体在提高玉米草甘膦抗性中的应用，包括：将所述的表达载体转化玉米愈伤组织或细胞，筛选得到抗性愈伤组织或细胞；诱导抗性愈伤组织或细胞分化，再生获得玉米抗性植株。本发明专利技术可显著提高玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省时高效、能耗少、成本低等诸多优点。
【技术实现步骤摘要】
含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用
本专利技术涉及一种叶绿体表达载体，尤其涉及一种含EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因玉米叶绿体表达载体及其构建方法，本专利技术还涉及该EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体在提高玉米草甘膦抗性中的应用，属于玉米抗草甘膦转基因工程领域。
技术介绍
1988年Boynton等首次利用基因枪法将带有atpB野生型基因的叶绿体DNA轰击了 atpB突变的衣藻，使其恢复了光合作用的能力，从而标志着叶绿体基因工程的开始。 1900年首次利用基因枪法将rrnie基因在烟草叶绿体中得到表达，拉开了高等植物叶绿转化的帷幕。水稻、玉米及小麦等禾本科植物是重要的粮食作物，但是叶绿体转化技术在禾本科植物的应用进展却很缓慢。2006年，Lee等首次将GFP和aadA基因成功重组到水稻 (Oryza sativa)叶绿体基因组中，为叶绿体转化技术在禾本科植物中的应用奠定了基础 (Lee, S. Μ.，et al.，Plastid transformation in the monocotyledonous cereal crop, rice (Oryza sativa)and transnmission of transgenes to their progeny. Mol Cells， 2006. 21 (3) :401-410.)。李轶女等(李轶女等.水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得.中国农业科学，2007. 40(9) :1849-1855.)选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点，将bar基因重组到水稻叶绿体基因中， bar基因在水稻基因组中正常的表达，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作为转化的筛选标记。Cui等利用基因枪法将GFP和npt II基因转化小麦未成熟盾片和花序，培养获得了转化植株，为叶绿体转化技术成功的应用到禾本科植物培育新的品种奠定了基础(Cui，C. ,et al. ， Stable chloroplast transformation of immature scutella and inflorescences in wheat(Triticum aestivum L. ). Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).43 (4) p. 284-91.)。叶绿体转化的表达效率高且外源基因可以定点整合，显花植物每个叶肉细胞含有约100个叶绿体，每个叶绿体含有约100个叶绿体基因组拷贝，如果完全同质化并有强启动子存在，外源基因可以得到高效的表达，同时叶绿体对外源基因的表达有很强的承受能力。叶绿体可以直接表达来自原核的基因；叶绿体基因组具有原核性，叶绿体基因组多顺反子转录、基因排列、调控方式、密码子的偏爱性等与原核性很相似。叶绿体的原核性利于原核来源基因的表达。但是真核基因在叶绿体基因中也能很好的表达。多基因可以同时转化，提高转化效率；叶绿体基因组具有重叠基因，是以多顺反子为转录单位，产生多顺反子 mRNA来合成蛋白质，所以由一个启动子引导下的多个外源基因可以同时在叶绿体中表达， 可实现多个基因的同时表达，多个外源基因可以同时进行表达，而不相互影响，避免因多个相同的启动子调控多个基因在表达时产生基因沉默现象。叶绿体转化没有载体序列，位置效应和多效应；属于母性遗传，后代材料稳定；安全性高。叶绿体是母系遗传，外源基因不会随花粉传播，造成基因漂移。草甘膦是一种高效、广谱、低残留、低毒、易被微生物分解和内吸传导的非选择性的除草剂，被广泛的应用于农业，其对大多数植物具有灭生性。由于草甘膦使用容易、高效、价格便宜，各国不断增加草甘膦的生产量满足日益增加的需求。转基因的抗草甘膦作物大面积推广给农民提供了草甘膦使用的新领域。1996年孟山都公司开发的抗草甘膦大豆 GTS40-3-2首次销售，到目前为止已经有超过1000个商业化的抗草甘膦大豆品种。迄今为止，抗草甘膦的大豆、棉花、玉米、花生、烟草、甜菜等作物得到了推广。2003 年全世界抗草甘膦大豆种植面积大于0.41亿hm2，其它抗除草剂的作物也大量的推广，主要是抗草甘膦品种。从已经推广的抗草甘膦作物来看，主要是美国的孟山都公司开发，转入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都将抗草甘膦作物种子与农达除草剂捆绑式销售，已经形成了独霸的局面。虽然从微生物、植物等克隆出了一些抗除草剂的EPSPS基因，也获得了相应的转基因植物，但是很少能达到推广的水平。目前中国国内还没有出现广泛推广的抗草甘膦的新品种。叶绿体转化体系具有表达效率高且外源基因可以定点整合，无论是真核还是原核的外源基因都可以在叶绿体中高效的表达，尤其是叶绿体属于母系遗传，后代材料稳定，安全性高，外源基因不会随花粉传播，造成基因漂移等优势，所以受到愈来愈多的重视。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体；本专利技术的目的之二是提供一种构建所述含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体的方法；本专利技术的目的之三是将所构建的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体应用于提高玉米的草甘膦抗性。为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，该含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体包括EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)编码基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及 rbcL ；其中，EPSP合酶编码基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。所述的EPSP合酶基因是公开号为CN1014^499A(专利技术名称高耐受草甘膦的 EPSP合酶及其编码序列)中所述的编码EPSP合酶的编码基因，该基因序列已在该专利文献 (CN101429499A)中全部公开(注EPSP合酶基因为CN101^9499A序列表中的SEQIDN0 2 或SEQID NO 3所示的核苷酸序列)。所述的EPSP合酶基因的表达盒由启动子、EPSP合酶基因和终止子组成；将EPSP 合酶基因置于所述玉米叶绿体特异启动子和终止子的调控之下，即得到本专利技术所述的EPSP 合酶基因的表达盒。其中，所述的启动子是玉米叶绿体特异启动子，例如，可以是prrn、 atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等启动子，优选的，所述的启动子为prrn启动子，本专利技术进一步地将prrn启动子序列进行了优化，将一段含有SD序列的序列(GGGAGG)引入prrn启动子的3’端，提高prrn启动子与核糖体的结合能力，从而提高下游基因的翻译水平，所得到的启动子的核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示；所述的终止子优选为psbA终止子，其核苷酸序列为SEQID NO :2所示。所述的同源重组片段atpB的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的同源重组片段rbcL的核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示。为了达到更好的效果，所述的EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体中还可含有显性选择标记基因的叶绿体基因表达盒；该显性选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因，更优选为抗潮霉素基因(HPT)，其核酸序列为SEQ ID No. 5所示；作为本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于，包括5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及 rbcL ；其中，5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒位于同源重组片段atpB 和rbcL之间。2.按照权利要求1所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于 所述的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒由玉米叶绿体启动子、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因和终止子组成。3.按照权利要求2所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于 所述的玉米叶绿体启动子包括/7r_r/7、ai/^、^对、/^似、/ZS秘WLrbcL启动子；所述的终止子为psbA终止子。4.按照权利要求3所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于 所述的/Trrz7启动子的核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示；所述/zs似终止子的核苷酸序列为 SEQID NO:2 所示。5.按照权利要求1所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于 所述的同源重组片段atpB的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的同源重组片段rbcL 的核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示。6.按照权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李轶女，张志芳，王金辉，王国增，程奇，倪丕冲，沈桂芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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