本发明专利技术公开了一种咽拭子标本手足口病EV71病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒及其检测方法，其采用设计引物和探针序列如下:lsy-VFP2：5’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’；lsy-VRP2：5’-CCGCRCTGCTGAAGAAACTA-3’；lsy-Probe2：5’-CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC-3’；本发明专利技术检测方法仅需要咽拭子标本就可能检测，方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种咽拭子标本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
肠道病毒71 型(EV71)是引起手足 ロ病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一，并可能导致各种神经系统疾病及并发症，以婴幼儿发病为主，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。近年来，国内外报道了多期肠病毒71型感染引起的手足ロ病群体性暴发的案例，成为威胁人类生命健康公共卫生问题。据卫生部统计数据，仅2010年全国累计报告手足ロ病例192344例，比2009年同期上升了 38.，其中重症2119例，死亡 94例。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪-口和/或呼吸道飞沫传播，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染。传统的肠病毒感染的诊断主要方法是从粪便、咽拭子标本分离病毒，以及病毒的血清型分离鉴定。分子生物学技术为WHO (世界卫生组织)推荐的病原检测手段，其可在短时间内确认病原、大幅节约检测时间和成本，敏感度和特异性也超越现有各类实验室检测技木。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供ー种快速有效、成本、低检测周期短、能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据的咽拭子标本手足ロ病EV71病毒 real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术咽拭子标本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒的引物和探针序列如下lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ； lsy-VRP2 :5， - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3，； lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3，。本专利技术咽拭子标本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR检测方法，具体为1)根据EV71病毒基因序列，设计引物和探针序列如下 lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ； lsy-VRP2 :5， - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3，； lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3，；2)提取待测样品RNA;3)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RTPCR反应体系中进行RT PCR反应；4)采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断結果，荧光RT PCR反应呈阳性，则待测样品含有EV71病毒核酸。进一歩，所述待测样品为咽拭子标本，所述待测样品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取。进ー步，所述RT PCR 反应体系为2XOne Step RT-PCR Buffer III 12. 5μ 1， TaKaRa Ex Taq HS 5 U/μ 1 0. 5 μ l,PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5 μ 1 ,RNase Free dH20 4.5 μ 1, ROX Reference Dye II 50 X 0. 5 μ 1，Primer 40 μ mol/L 各 0. 5μ 1, Probe 10 μ mol/L 0. 5 μ 1。进一歩，所述RT PCR 反应的反应条件为42°C 8min ；95°C IOs ；95°C 5s ；58°C 34s, 45 Cycles ；退火温度按、56°C、58°C、60°C分別试验优化，退火温度为58度吋，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最強，本方法选择58度作为退火温度进行所述RT PCR反应。本专利技术检测方法仅需要咽拭子标本就可能检测，方便了临床医生和ロ岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。附图说明图1为实时PCR最低检测限反应曲线； 图2为实时PCR重复性反应曲线；图3为CUT OFF值的确定10倍梯度系列稀释反应曲线； 图4为CUT OFF值的确定最低稀释度检测反应曲线； 图5为CUT OFF值的确定阴性样本检测反应曲线。具体实施例方式肠道病毒EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，因此建立一种特异敏感高效快速的实验室检测方法非常重要。实现对可疑肠道病毒早期诊断是控制手足ロ足病传播的有效方法之一。本专利技术建立的肠道病毒EV71实时荧光PCR检测方法仅需要咽拭子标本就可以检測，方便了临床医生和ロ岸检疫工作者采样操作。本研究建立的方法与肠道病毒诊断标准方法比对结果一至，但本方法所用试剂成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。本专利技术的关键步骤之一就是引物探针的设计，我们从NCBI数据库检索到截至 2011年3月1日的所有肠道病毒EV71病毒基因序列，经相关生物信息学软件反复比对设计，最终确定了该病毒VPl基因的保守区域设计，而且在试验中我们也选取了多套自己设计的引物探针序列实验比对，最终确定了一套最佳检测用引物探针序列。本专利技术ー种咽拭子标本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒的引物和探针序列如下lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ； lsy-VRP2 :5， - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3，； lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3，。本试剂盒中还包括dNTP，MgC12, RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。本专利技术ー种咽拭子标本手足ロ病EV71病毒real-time RT-PCR检测方法，具体过程为1)根据EV71病毒基因序列，设计引物和探针序列如下 lsy-VFP2 :5’ -TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’ ； lsy-VRP2 :5， - CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3，； lsy-Probe2 :5’ - CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3，；2)提取待测样品RNA;3)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RTPCR反应体系中进行RT PCR反应；4)采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断結果，荧光RT PCR反应呈阳性，则待测样品含有EV71病毒核酸。其具体分析过程和处理过程如下 1、材料与方法1.1材料1. 1. 1阳性标本肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒A16型病毒株均为武汉生物制品研究所基因工程室提供。81份EV71阳性咽拭子标本由四川国际旅行卫生保健中心提供。 人A型流感病毒、2009甲型Hmi流感病毒、B型流感病毒阳性咽拭子标本均为本实验室测序确证样本、H5N1和H9N2核酸为北京⑶C馈赠。1. 1. 2阴性标本采集的156份正常人咽拭子来自深圳ロ岸医院正常人群。1. 2 方法1.2.1引物和探针的设计从NCBI-Geneb本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜牙，朱玉兰，王佃鹏，叶健忠，叶卫翔，甄胜西，黄彤文，
申请(专利权)人：深圳国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：
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