本发明专利技术属于医学生物工程技术领域，它涉及一种新型树突状细胞(DC)疫苗制备技术。该技术将人端粒酶催化亚基(hTRT)基因插入腺相关病毒(AAV)，然后对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原为肿瘤相关抗原，因此该DC疫苗刺激的淋巴细胞几乎对所有肿瘤细胞均产生强大杀伤作用。该发明专利技术制备的疫苗具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。解决了现有体外抗原肽转染DC细胞存在的半衰期短、转导效率低、活化免疫效应细胞能力弱的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物工程
，它涉及一种新型树突状细胞(DC)疫苗制备技术。该方法将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，并对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原为广谱肿瘤相关抗原，在几乎所有的肿瘤细胞均有表达，而正常细胞几乎不表达hTRT，因此该DC疫苗刺激的淋巴细胞几乎对所有肿瘤细胞均产生强大杀伤作用，避免了治疗的毒副作用。
技术介绍
近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机理的认识以及肿瘤相关抗原的发现及鉴定，以树突状细胞(DC)抗肿瘤疫苗为代表的主动免疫治疗成为肿瘤防治研究的热点。DC是人体内抗原递呈能力最强、唯一能在体内活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者。DC细胞是以主要组织相容性复合物MHC I、II类肽复合物的形式递呈抗原，具有促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中发挥着极其重要的作用。因此被广泛应用于肿瘤疾病疫苗研究。研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，导致免疫功能低下的原因之一是人体内DC细胞功能的下降。实验证实，从外周血分离出的淋巴细胞仍对多种抗原刺激保持很好的反应能力。因此，通过体外制备DC瘤苗有望成为治疗肿瘤的理想疗法。如何选择肿瘤抗原并有效地将其导入DC细胞成为问题的焦点。目前肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)，TSA只存在于某种肿瘤细胞，缺乏广谱表达，而TAA在肿瘤组织中广泛表达，能够诱导针对多种肿瘤CTL杀伤效应，故成为肿瘤DC疫苗研究热点。研究发现，人体90 %的肿瘤存在端粒酶的活化，被激活的端粒酶在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用，而端粒酶催化亚基(hTRT)是端粒酶的蛋白亚单位，与细胞端粒酶的活性密切相关，也是迄今报道表达最广泛的肿瘤相关抗原之一，因此选择hTRT 作为癌症治疗DC疫苗的抗原具有重要价值。如何能有效地将肿瘤抗原成功加载并导入DC细胞是获得良好活性DC的关键。目前抗原加载常用两种方法一是抗原肽直接导入DC细胞，二是病毒载体携带抗原基因感染 DC细胞。抗原肽直接冲击存在以下不足(1)抗原肽半衰期短，易降解；(2)目前使用的抗原肽大多来源于细菌表达的基因工程产品，递呈的抗原信息缺乏特异性。而采用病毒携带抗原基因感染DC制备瘤苗可以克服上述不足(1)抗原基因通过特定的载体转染DC细胞后，可整合于DC染色体内，从而实现抗原基因长期稳定表达；(2)将抗原基因感染DC细胞后，可以在蛋白翻译后做进一步的修饰，保证抗原信息的完整及特异。目前携带抗原基因感染DC细胞常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。这三种病毒载体中，AAV用于感染DC细胞更具有优势=(I)AAV全长仅为51Λ左右，自身免疫原性低，避免了腺病毒较高免疫原性的缺点；( 可将携带基因定向整合于人类的第19号染色体上，保证基因长期稳定表达，不存在逆转录病毒载体随机整合易诱发癌变的危险，具有很高的安全性；(3) AAV感染谱广，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞，且能上调DC细胞表面标志⑶80、⑶83、⑶86等的表达，从而上调DC细胞的功能。研究表明，甘露糖受体(MR)属于C2型凝集素家族成员，是DC细胞和巨噬细胞所特有的膜受体，能有效捕获甘露聚糖糖基化的分子。未成熟的DC细胞表面高水平MR，能识别甘露聚糖修饰的病毒表面上的多种糖分子，介导高效的抗原识别与摄取作用，因此AAV 甘露聚糖修饰后对DC细胞具有很强的靶向性，从而大大提高了对DC细胞的感染效率。综上所述将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，然后对其进行甘露聚糖表面修饰， 使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。经致敏后DC细胞刺激的CTL几乎对所有肿瘤可产生强大杀伤作用，而对正常组织无损伤，该专利技术制备的以甘露聚糖修饰携带hTRT基因的AAV病毒转染的DC疫苗，具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是克服现有方法制备的DC疫苗存在体外抗原肽转染DC半衰期较短、转导效率低、靶向性差、活化免疫效应细胞能力弱的缺点。提供。本专利技术通过甘露聚糖修饰携带hTRT基因的重组腺相关病毒体外靶向感染DC细胞，随着hTRT基因的在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得大量、持续hTRT抗原肽刺激，经致敏后DC细胞活化淋巴细胞，产生的CTL几乎对所有肿瘤可产生强大杀伤作用果，具有更好的抗肿瘤效果。本专利技术技术方案如下包括甘露聚糖修饰的携带hTRT基因的重组腺相关病毒 AAV/hTRT的制备；采集并分离患者外周血单个核细胞，培养于6孔板，贴壁3h，轻轻洗去悬浮T细胞并冻存备用；取贴壁细胞每孔加入AAV/hTRT病毒液0. 5ml (1.0X108eg)，感染 5h后更换为新鲜含有重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)SO万U/L、白细胞介素 4(IL-4)100RU/LAIM V培养基即获得未成熟的肿瘤相关抗原DC疫苗；第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC细胞按DC T= 1 20比例混合，以AIM V为培养基，同时加 Λ GM-CSF (80 万 U/L)，IL-4 (100 万 U/L)、IL-2 (1 万 U/L)及 TNF- α (20 μ g/L)，共育 7 天， 诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。本专利技术所述的培养基为AIM V培养基且添加10%自身血浆。患者外周血单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法收集。所述的DC细胞是采用细胞因子GM-CSF、IL-4、 TNF- α诱导分化所得。所述的GM-CSF终浓度为80万U/L，IL-4终浓度为100万U/L及 TNF- α终浓度为20 μ g/L。DC细胞经重组腺相关病毒感染致敏后与原先冻存的T细胞按比例混合，共育7天后诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。综上所述甘露聚糖表面修饰的腺相关病毒(AAV)，能体外靶向感染DC细胞。该专利技术制备的以甘露聚糖修饰携带hTRT基因的AAV病毒转染的DC疫苗，具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。具体实施例方式下面用实施例来具体说明本专利技术，但本专利技术并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。实施例1 甘露聚糖修饰的重组腺相关病毒AAV/hTRT的制备1、通过RT-PCR技术获取一段人源性的TRT基因(hTRT，全长3. 5kb)；2、将hTRT基因克隆入腺相关病毒载体AAV(dl6-95)，构建重组质粒AA(dl6_95) (简写为AAV/hTRT)，pSH3包装系统制备AAV/hTRT病毒；3、AAV/hTRT扩增和纯化AAV/hTRT病毒反复感染裂解293细胞扩增病毒。超速离心法，收集获得纯化病毒带。PBS液透析脱盐后置于-80°C保存备用。病毒滴度测定采用半数组织培养感染量(TCID 50)方法；4、AAV/hTRT的甘露本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑骏年，李连涛，李慧忠，张宝福，刘俊杰，张青，杨洁，章龙珍，裴冬生，
申请(专利权)人：郑骏年，
类型：发明
国别省市：
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