本发明专利技术涉及一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法和应用，是利用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，其中：所述的一对特异性引物为：上游引物SEQ?ID?NO.1和下游引物SEQ?ID?NO.2；对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分析中，根据172bp处是否出现特异条带来判断样本是否与亚细亚镰刀菌相关；所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记，SRAP标记的序列为SEQ?ID?NO.3，其大小为172bp。本发明专利技术可以用于对亚细亚镰刀菌的鉴别，或用于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用，属于作物病害诊断和病原菌鉴定的
技术介绍
由镰刀菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一种广泛流行的世界性病害，主要发生于温暖湿润地区，是影响小麦高产、稳产和优质的重要因素之一。19世纪90年代以来，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病灾情严重。我国南方长江中下游冬麦区发生严重，随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区以及西南和西北麦区扩展(Ma等，2008)，几乎蔓延到所有小麦种植区。2003年，长江中下游地区60-80%的麦区感染赤霉病，减产超过20%。2005 年，江苏省赤霉病的发生面积为1800万亩左右，占全省总种植面积的72%。全国农业技术推广服务中心预报2011年赤霉病在全国流行面积为6500万亩。小麦赤霉病的发生与流行还带来巨大的食品安全性隐患。镰刀菌可以产生单端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉会发生呕吐、腹泻及食欲不振等急、慢性中毒症状，严重者可导致死亡(陆维忠等，2001)。据美国估计，因此类毒素污染所造成的直接经济损失仅1991 1996年间就高达三亿美元。我国、欧盟和美国、加拿大均要求面粉、面包、饼干等食品中DON毒素的限量标准为1000 μ g/kg(Ippm) (Buerstmayr等，2009 ;GB 163四_1996)。因此，明确我国小麦赤霉病致病菌的种类与产毒类型，对开展小麦赤霉病防治与抗病育种都有重要的实践意义。自20世纪40年代中国首次报道小麦赤霉病以来，国内外研究认为，禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum Schwabe)是小麦赤霉病的主要致病菌之一，也是中国小麦赤霉病的优势致病菌。近年来的研究表明，F. graminearum是一个含有许多特定种系的复合种 (Fg Complex)，0’ Donnell通过系统发生学分析，将FgComplex划分成13个特定的正式命名的种。根据该项研究结果，目前中国小麦赤霉病的主要致病菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和亚细亚镰刀菌(Fusariumasiaticum)。其中亚细亚镰刀菌在长江中下游麦区、南方麦区和西南麦区均为优势致病菌，并且不断向黄淮麦区、北方麦区迁移(aiang， 2010)。研究还表明，产生3AD0N毒素的亚细亚镰刀菌群日益扩展，并具有更强的致病力，危害性更大(aiang，2oio)。因此，快速、准确鉴定检测亚细亚镰刀菌，有利于针对性地加强对小麦赤霉病的防治。传统的镰刀菌鉴定方法主要通过形态学，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐，没有统一的规范标准，并且需要丰富的实践经验。随着遗传与分子生物学技术的迅速发展，营养体亲合群(Vegetative compatibility group VCG)，分子标记也成为鉴定镰刀菌的主要技术手段。与常规的形态鉴定法相比，分子标记能准确、快速地从混合群体中鉴定出不同病菌类型，为准确、快速分析病菌的群体分布、特点和鉴定诊断提供新方法。Nicholson等(1998)找到了一对鉴定禾谷镰刀菌Fg Complex的标记Fgl6F/R，但在扩增来自不同地区的禾谷镰刀菌株时得到6种PCR产物，不能有效地区分菌株的种类。 Qu等Q008)利用该对引物，并结合AFLP标记，鉴定出Fgl6F/R扩增类型5和AFLP扩增类型B的菌株为亚细亚镰刀菌。由于AFLP标记操作繁琐，且涉及到酶切和两次PCR扩增等步骤，难以在实际检测中推广应用。Yang等O008)利用氨连接酶基因的单核苷酸多态性 (SNP)设计了 4个引物试图来区分Fg complex中的七个种，其中鉴定亚细亚镰刀菌需要扩增出536bp、388bp、311bp、162bp等4条不同大小的条带，并且还需要通过条带的强弱进行辅助判断，并不能真正满足快速简易检测的要求。目前，一种针对所有亚细亚镰刀菌具有特异性的引物，未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前对亚细亚镰刀菌的鉴定方法过于复杂，或只能针对个别亚细亚镰刀菌，在预防亚细亚镰刀菌对农作物和饲料污染，以及在鉴别病原菌等一系列实际应用中存在明显的局限性的实际问题，提供一种由新的特异性引物组成的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用。本专利技术的目的是这样实现的一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，是利用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，其特征在于所述的一对特异性引物为上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物 SEQ ID N0. 2;对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分析中，根据172bp处是否出现特异条带来判断样本提取的DNA是否与亚细亚镰刀菌相关；所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记， SRAP标记的序列为SEQ ID N0. 3，其大小为172bp0在本专利技术中DNA是通过改良CTAB法或改良SDS法从样本中提取的。在本专利技术中所述样本提取的DNA是指从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA。在本专利技术中所述的农作物是指麦类农作物。在本专利技术中所述样本提取的DNA是指病原菌基因组样本提取的DNA。在本专利技术中PCR扩增，反应体系 20yL，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2 μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上游及下游引物各 2 μ L，1. 0 U Taq酶，ddH20补齐至20 μ L ；PCR扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后95°C变性 45sec，60°C退火30sec，72°C延伸45sec，共；35个循环；最后一个循环为72°C延伸lOmin，扩增产物4°C保存。在本专利技术中所述的电泳是指在2%琼脂糖凝胶中用IXTAE缓冲液中电泳 30min,电压为4-5V/cm的条件下凝胶成像。一种上述检测方法的应用，其特征在于用于对亚细亚镰刀菌的鉴别，或用于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。在所述检测方法的应用中所述的用于对亚细亚镰刀菌的鉴别是指从病原菌基因组样本中提取的DNA，当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该病原菌为亚细亚镰刀菌。在所述检测方法的应用中所述的用于亚细亚镰刀菌对农作物污染的监控是指 从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA ；当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该农作物籽粒或饲料样本已经被亚细亚镰刀菌污染。本专利技术的优点在于1. 一对特异性引物能够针对目前所知的各中亚细亚镰刀菌都能够扩增一个特异性产物，对鉴定亚细亚镰刀菌具有特殊的意义。2.采用一对引物进行 PCR扩增，操作步骤少，操作方法简单；3. PCR扩增产物为一个特异性产物，不需要通过几个产物或者多条条带来鉴定菌株，利用本方法，能扩增出产物的即为亚细亚镰刀菌，扩增不出的即为其他菌株，测定结果简单明了 ；4.本方法所需的DNA量较少，10-20n本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张旭，周永进，马鸿翔，余桂红，孙晓波，王磊，邢锦城，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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