本发明专利技术公开了一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的改性载体为经过pH8～10.5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit?C250L。本发明专利技术还公开了上述固定化酶的制备方法和应用。本发明专利技术所得到的固定化酶具有性状均一、酶稳定性强、重复使用性能好、对反应环境pH值适应性强等特点，进一步提高了γ-谷氨酰转肽酶的稳定性，并实现了新型固定化酶在茶氨酸合成中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。
技术介绍
生物催化反应具有条件温和、选择性高、反应效率高等特点，因而越来越多地应用于化学合成领域。但由于生物酶在体外工业环境下的稳定性差以及酶制剂的成本过高，极大地限制了生物催化在工业领域的实际应用。固定化酶技术通过将酶分子束缚(或结合) 于特殊的相，不仅有效解决了催化剂的重复使用问题，同时还可显著改善生物酶的稳定性及催化特性(底物亲和力、立体选择性等)。目前，作为固定化酶技术的一个重要分支，高性能酶固定化载体的开发和应用十分活跃。研究内容广泛涉及载体的合成、表征，以及载体的几何参数、表面性质、表面活性及理化性质等对于酶的固载量、酶活回收率和稳定性等方面的影响。但有关载体表面电荷性质对酶催化活性及稳定性的影响却鲜有系统的研究。研究表明，不同基质的酶固定化载体的表面电荷性质(pzc值)不同，导致其表面环境的PH值产生差异，而过高或过低的pH值不仅会降低酶的催化效率，同时也将影响酶分子结构的稳定性。因此，在选择酶固定化载体时，不仅仅要考虑酶负载量的大小和连接的牢固性，同时也需兼顾载体表面电荷性质，使其与酶的最适作用条件相匹配。但由于目前缺乏各类载体表面电荷性质的相关数据，使得人们在选择载体时盲目性较大。环氧基载体Eupergit C250l是一种常用的酶固定化载体，由单体聚合而成的多孔小球状树脂，参与聚合的单体有N，N’_亚甲基-双丙烯酰胺、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸酯。商品化的Eupergit C250l粒径分布在100 250 μ m的小球状颗粒，树脂上的微孔直径90 130nm，担载量200 μ mol环氧基团/g干树脂。Eupergit C250l具有良好的化学稳定性，机械强度高，其pzc值为6. M。目前以Eupergit C250l为载体的酶固定化研究很多，但对各种酶的固定化效果差异巨大(酶活回收率从8% 92%不等)。尽管不排除固定化过程对酶构象的机械性拉伸和扭曲以及对传质的影响，但载体自身电荷环境对酶分子构象以及表观催化性能的影响也是巨大的。目前，通过在Eupergit C25%表面接枝特定pH缓冲范围的载体两性电解质，制备具有缓冲性能的功能性载体，并将其用于酶固定化的研究尚未见报道。y -谷氨酰转肽酶(γ -glutamyltranspeptidase, GGT,最适作用 pH 8. 5 9. 5) 可特异性地将Y-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含Y-谷氨酰基的化合物，该反应成为谷氨酰基化反应。通过改变受体种类可获得不同的谷氨酰化合物。由于该反应具有位点特异性和光学选择性强、无需对反应物进行保护和脱保护、反应过程中也不消耗ATP 等特点，因此利用该反应制备系列Y-谷氨酰基类化合物的研究正在成为工业生物催化领域的研究热点。目前该反应已成功地应用于一些重要谷氨酰化合物的合成，如Y-L-谷氨酰-L-多巴、谷胱甘肽、Y-D-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸以及茶氨酸等。但由于GGT在体外环境下易发生亚基解聚，引起酶活的不可逆下降，限制了其应用范围的进一步拓展。目前，对Y-谷氨酰转肽酶的固定化及稳定化研究较少，且以载体两性电解质改性材料为载体的GGT固定化及应用均未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种以改性后的环氧基树脂为载体的固定化酶，以进一步提高Y -谷氨酰转肽酶对环境PH值的适应性，以及酶的稳定性和催化活性，降低制备茶氨酸的工艺成本。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述固定化酶的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述固定化酶在催化合成茶氨酸中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性载体，所述的酶为Y-谷氨酰转肽酶，所述的改性载体为经过PH8 10. 5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C25。l。其中，所述的改性载体按如下方法制备得到将干燥后的环氧基树脂Eupergit C250l加入pH8 10. 5的载体两性电解质中，常温下搅拌反应16 20h后，将液体滤出，固体颗粒分别经纯水反复淋洗、0. 5mol/L的NaCl溶液反复淋洗、纯水反复淋洗三道淋洗后烘干即制得改性载体。其中，所述的pH8 10. 5的载体两性电解质为pharmalyte 8-10. 5，液态，CAS 号为17-0455-01，缓冲范围为pH 8 10. 5，生产厂商为GE healthcare，原溶液浓度为 0. 36meq/mL。其中，所述的环氧基树脂EupergitC25ql为Eupergit C250L，CAS号为 149531-08-8， 生产厂商为FLUKA，EupergitTM C25tlL为N，N’_亚甲基-双丙烯酰胺、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸酯共聚物，粒径分布在100 250 μ m的小球状颗粒，树脂上的微孔直径90 130nm， 环氧基团浓度大于等于200 μ mol/g干树脂。其中，对于每g干重环氧基树脂Eupergit C25Ql，载体两性电解质的用量为10 20mLo其中，将pH8 10. 5的载体两性电解质用浓度为50% (ν/ν)以上的ρΗ8 10. 5 的载体两性电解质水溶液替换。其中，所述的烘干条件为真空干燥箱内干燥48 72h，干燥温度不高于40°C。上述以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶的制备方法，将改性载体加入Y -谷氨酰转肽酶溶液中，于常温下振荡反应1 证(优选2. 5h)，将液体滤出，固体颗粒纯水淋洗 3 4次，烘干后即得。其中，所述的γ -谷氨酰转肽酶溶液的浓度为0. 25 0. 30mg/mL。其中，对于每g干重改性载体，Y-谷氨酰转肽酶溶液的用量为10 20mL。其中，所述的烘干条件为真空干燥箱内干燥48 72h，干燥温度不高于40°C。上述制备得到的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶最终水淋洗吹干后置于冰箱4°C保存，制得的固定化酶具有很好的化学稳定性、结构稳定、有很好的机械操作强度、表面富含-NH2和-C00H，极易与酶分子间形成氢键或离子键。上述以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶在催化合成茶氨酸中的应用。载体两性电解质Pharmalyte，以下简称CL·经过pH8 10. 5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C250l,即改性载体，以下简称ECCA。以上述改性的环氧基树脂为载体的固定化Y-谷氨酰转肽酶，以下简称 ECCA-GGT。有益效果本专利技术充分利用环氧基树脂Eupergit C250l的良好特性，通过在其表面共价键合缓冲范围在PH8 10. 5的载体两性电解质制备新载体ECCA，制备得到的ECCA 电荷零点值为9. 1，接近GGT的最适作用pH值，且ECCA载体形状均一、稳定性高、表面富含-COOH和-NH2，为固定化γ -谷氨酰转肽酶提供了良好的操作条件。以本专利技术方法制备的ECCA-GGT形状均一，酶活力回收率平均达到19. 22% ；在纯水中，固定化酶ECCA-GGT的最大反应速度为缓冲体系下的81% 95. 8% ；与游离酶相比， 固定化酶的最适作用PH和温度略有改变，适用pH和温度范围均有一定程度的增大；固本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚忠，杨敬，王浩绮，周治，房鑫，徐虹，韦萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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