一种从人胚胎干细胞分化成神经细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，所述方法为：将人胚胎干细胞进行分离纯化，获得人胚胎干细胞单体，将人胚胎干细胞单体按1～5×104个/cm2的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞进行预诱导，再以诱导培养基Ⅱ进行分化诱导培养，获得神经细胞；本发明专利技术可克服已有分化方法中神经细胞异质程度大，分化效率低、不便实时观察和操作，需要后期分选过程等弊端，具有操作简便、诱导周期短(10～12天)、神经细胞均一度高(比例高达85％)等优点，电生理检测发现该神经细胞具有惊厥样放电功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发育生物学、细胞生物学和细胞治疗领域，更具体地涉及一种人胚胎干细胞定向分化技术，本专利技术提供了在体外将人胚胎干细胞诱导为神经细胞的新方法。
技术介绍
细胞移植治疗神经系统疾病是当今生物医学研究的一个热门领域，尽管目前细胞治疗已经取得很大进展，但由于细胞来源及供体短缺等因素，限制了其临床应用的步伐，同时也带来伦理道德的争论。胚胎干细胞是能在体外培养的高度未分化细胞，具有多潜能性， 可以诱导分化成多种组织细胞。将胚胎干细胞定向诱导分化成特定类型的神经细胞，不但可以解决上述问题，还可以使供体细胞对不同神经系统疾病更具靶向性。胚胎干细胞体外分化为神经细胞的研究始于1981年，迄今为此，诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的方法通常有无血清诱导法、全反式维甲酸诱导法、可溶性因子诱导法、基质细胞共培养法等。人胚胎干细胞定向分化面临的一个关键问题就是分化效率和分化细胞的均勻性。胚胎干细胞在培养和分化过程中，如果细胞以悬浮方式培养时，它们会聚集形成球状细胞团(拟胚体)。拟胚体一般具有外、中、内三胚层结构，且其体外生长分化能够模拟正常胚胎的发育过程。目前，胚胎干细胞定向分化的研究很大部分都是围绕这一基础进行的。然而，这一方法也存在着诸多弊端，首先三胚层结构复杂，细胞种类多且分布不均；其次操作程序繁杂，前期需要制作拟胚体，后期还得筛选目的细胞。本专利技术的基本策略是使人胚胎干细胞在单细胞的状态下尽快贴壁，避免其形成拟胚体状态，不仅排除各胚层细胞之间复杂的相互作用的干扰，且使得所有的胚胎干细胞处于均一的分化环境。丁酸钠属于一类短链脂肪酸，它能够抑制组蛋白脱乙酰基酶的活性，2003年 Geron公司研究人员发现丁酸钠可通过拟胚体途径诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞， 随后也有文献报道丁酸钠可诱导胚胎干细胞分化为胰腺细胞，这说明丁酸钠抑制组蛋白脱乙酰化作用并不是针对某类细胞谱系特异基因所在的染色质特定区域，它只是随机地松散染色质。本专利技术先利用丁酸钠打破组蛋白乙酰化的平衡，促使染色质松散，从而抑制胚胎干细胞增殖，使其尽快进入分化状态；结合单层直接贴壁分化方法并添加特定的诱导培养基， 即可在相对短的时间里获得高比例的神经细胞。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种在体外将人胚胎干细胞诱导分化成神经细胞的新方法，所述方法是以丁酸钠作为分化诱导剂，联合神经诱导培养液，通过人胚胎干细胞直接单层贴壁、二步诱导途径实现的。本专利技术所用细胞材料和试剂说明如下A，人胚胎干细胞(hESCs)本专利技术所述人胚胎干细胞可以以任何方式获得，都可用于本专利技术，如各种文献中公开确立的hESCs，保藏机构或者商家购买得到的hESCs，流产胚胎或不同发育阶段的囊胚分离得到的hESCs均可，本专利技术采用的Hl人胚胎干细胞系购自WiCell Research Institute, Madison WI, USA.，NIH 编号 WA01，参见 http://wicell. org八B，培养液及试剂本专利技术所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本专利技术的细胞基本培养基可以包括但不仅限于DMEM、MEM、RPMI1640, F_10、 F12、α MEM、KO-DMEM以及IMDM。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。他们可以包括但不限于氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。作为举例，本专利技术可使用包含如下成分组合的培养基，除非另外指出，本专利技术所用试剂均购自invitrogen公司。(1)人胚胎干细胞培养液基本培养基K0-DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)10% KO-血清替代物；10%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ-巯基乙醇；非必需氨基酸；10U/ml人白细胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素；4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) ；ρΗ7· 0 7. 4。(2)诱导培养基I:基本培养基DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)15%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；非必需氨基酸；100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素； ρΗ7· 0 7. 4。(3)诱导培养基II:基本培养基KO-DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)50% Ν2/Β27 ；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ -巯基乙醇；1 %非必需氨基酸；10U/ml人白细胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml 青霉素；100ug/ml 链霉素；ρΗ7· 0 7. 4。本专利技术提供一种从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，所述方法为将人胚胎干细胞进行分离纯化，获得人胚胎干细胞单体，将人胚胎干细胞单体按1 5 X IO4个/cm2 的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞进行预诱导，再以诱导培养基II进行分化诱导培养，获得神经细胞；所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质；所述诱导培养基II 以KO-DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质。进一步，优选所述人胚胎干细胞按3 X IO4个/cm2的细胞密度进行单层贴壁诱导培养。所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质15%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。所述诱导培养基II以KO-DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质50% 的N2和B27血清替代物，15% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG, 1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。所述丁酸钠在诱导培养基I中的终浓度为1 10mM，优选1 5mM，更优选2. 5mM。所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞于37°C，5% CO2, 100%湿度条件下预诱导培养1 3天，倾去培养液，再加入诱导培养基II中继续于37°C， 5% CO2,100%湿度条件下分化培养8 14天，获得所述神经细胞。进一步，所述预诱导培养优选2天，分化诱导培养优选8 12天。进一步本专利技术从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法所述诱导方法包括如下步骤(1)人胚胎干细胞的扩增和纯化；( 人胚胎干细胞单层贴壁及预诱导；C3)神经细胞的分化诱导形成，具体为(1)分离纯化人胚胎干细胞；将人胚胎干细胞接种至0. 1 2%明胶包被的培养孔板中的小鼠成纤维饲养层细胞上，于人胚胎干细胞培养液中，37°C，5% C02，100%湿度条件下培养5 8天，获得小鼠成纤维细胞和扩增后人胚胎干细胞的细胞混合物；获得的细胞混合物于消化液中，37°C 消化5分钟，获得悬浮液并置于含人胚胎干细胞培养液的0. 1 2%明胶包被的培养瓶中， 37°C贴壁培养1 2h，小鼠成纤维饲养层细胞将贴壁，而人胚胎干细胞大部分仍悬浮于培养液中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄华荣，杨晓娟，张遵义，张铭，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：