本发明专利技术提供了与抗病毒免疫相关的猪ISG60基因的TPR(tetratricopeptide?repeat)结构基序，ISG60基因的TPR结构基序含有病毒感染相关的调控元件序列，与现有报道的猪基因的TPR结构没有显著同源性。本发明专利技术还具体地涉及到猪ISG60基因的策略，鉴定了ISG60基因在细胞中的定位，通过ISG60基因的TPR结构基序，能够用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家畜基因工程领域，具体涉及与猪抗病毒免疫相关基因结构基序。
技术介绍
猪是全球最为重要的畜禽产品之一。猪瘟是猪的一种有重大经济意义的烈性传染病，全世界每年因为猪瘟造成的经济损失巨大。因此研究猪的抗猪瘟病毒免疫具有重大意义。猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)是猪瘟的病原，潜伏期小时，其病毒粒子呈圆形，属于黄病毒科瘟病毒属，大小为38 44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1. 15 1. 17g/ml，有包膜，在细胞质内复制。猪瘟病毒危害猪和野猪，俗称“烂肠瘟”，是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。自1933年在美国俄亥俄州发现猪瘟病以来，猪瘟一直是威胁世界养猪业最严重的疾病之一，每年给各国造成高达几十亿美元的损失，我国每年的养猪量约为10亿头，猪的死亡率超过10%，死亡的第一大原因就是猪瘟，直接经济损失高达40亿元。目前对猪瘟的防治方法是保持猪舍干燥、清洁，夏季注意通风，猪舍、用具经常消毒。注意气候变化，加强饲养管理。早发现，早隔离，早治疗。最近几年，人们开始研究抗猪瘟病毒基因，并采用克隆方法表达，发表了一些文献，例如题名世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”诞生作者王浩然刊名中国兽医学报.2008 (9).文摘2008年9月9日，世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在位于中国长春的吉林大学农学部诞生。这标志着人类首次培育的“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”获得了成功。9月9日17:40至19:10，在吉林大学原种猪场，3头“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”先后顺利诞生，体质量分别为1 050、1 100和550g。猪瘟是一种严重威胁养猪业的传染病。为了培育出能够抗猪瘟病毒的猪，以吉林大学农学部畜牧兽医学院赖良学教授为首席专家和军事医学科学院军事兽医研究所的专家共同组成的课题组，在国家自然科学基金资助的基础上，经过近2年时间的协作攻关，将能抑制猪瘟病毒的基因转染到“中国实验小型猪”胎儿成纤维细胞内，并以此体细胞进行核移植制备猪克隆胚胎， 将此胚胎移植到杜洛克代孕母猪体内，怀孕114d后顺利产出3头健康的克隆仔猪。经对仔猪体细胞进行基因检测，证实该克隆猪的细胞带有所转入的抗猪瘟病毒基因。进一步的抗病毒检测实验正在进行中。世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”诞生。题名猪瘟病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及鉴定作者周斌刘珂陈溥言机构南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，刊名病毒学报.2008，M(6) :451-45文摘根据猪瘟病毒衣壳蛋白(C)基因序列设计一对引物， RT-PCR扩增获得编码猪瘟病毒衣壳蛋白的C基因，将其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN) 基因的真核表达载体ρ⑶NA-SN中，筛选获得重组质粒ρ⑶NA-C-SN。脂质体转染猪肾细胞 (PK-15)，并经G418稳定筛选，通过RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光鉴定表达的融合蛋白，体外DNA消化试验检测核酸酶活性。结果表明融合蛋白C-SN在H(-15细胞中获得了稳定表达，能够被兔抗猪瘟病毒衣壳蛋白多抗所识别，并具有良好的核酸酶活性，能够对DNA 进行切割。同时，稳定表达融合蛋白C-SN的H(-15细胞系能够有效抑制猪瘟野毒的增殖， 使其感染性降低IO2 IO3倍。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。尽管目前使用的猪瘟疫苗对猪有很好的保护作用，但猪瘟却始终无法得到彻底的根除，而且猪瘟病毒的感染在临床上也出现了新的特点，除了一般看到的急性临床症状外， 还有一些不表现明显临床症状的温和型猪瘟或亚临床型猪瘟，但抗体检测和基因检测都呈阳性，也就是所谓的持续性感染状态，长期携带病毒而不表现临床症状的猪就成为重要的传染源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与猪抗病毒免疫相关基因结构基序，以通过该结构基序，找出能够用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该蛋白基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。本专利技术人从经过干扰素刺激的猪肾细胞H(-15中抽提总RNA，反转录，PCR扩增， 得到了一种与猪抗病毒免疫相关的ISG60基因，该ISG60基因的TPR(tetratriCOp印tide repeat)结构基序含有病毒感染相关的调控元件序列，与现有报道的猪基因的IPR结构没有显著同源性。ISG60基因是由1530个碱基组成，含有完整的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)，它的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。本专利技术人首先克隆了猪ISG60基因的策略和ISG60基因的特异性引物，对病毒、细菌感染有免疫作用的I型干扰素介导刺激机体产生的猪ISG60基因，以及通过间接免疫荧光的方法(用倒置荧光显微镜观察)鉴定ISG60基因在冊-15细胞中定位的策略，从而为进一步构建各种表达载体，用于研究ISG60基因抗病毒的反应机理以及病毒与宿主间互相作用奠定基础。所述的抗病毒免疫相关的猪ISG60基因的IPR结构基序和细胞定位，包括以下的步骤(1)基因在染色体上的定位；(2)基因片段的获得；(3)载体构建；(4)基因在细胞上的定位所述的基因在染色体上的定位，首先是采用猪全基因组芯片分析猪外周血淋巴细胞的基因表达谱，发现ISG60基因在猪瘟病毒感染后表达量增多，在感染后6天该基因的表达量最多。通过将ISG60基因的EST序列与NCBI数据库中公布的猪基因组序列进行比对， 获得了 ISG60基因在猪染色体上的定位。所述的基因片段的获得，首先是采用重组人I型干扰素IFN- α 2b刺激猪肾上皮细胞H(-15细胞系介导产生ISG60基因。干扰素是一种哺乳动物细胞产生抗病毒蛋白质，主要分为I型、II型干扰素，其中α、β干扰素属于I型干扰素，Y干扰素属于II型干扰素， 干扰素中主要成分是I型干扰素。干扰素刺激猪肾细胞冊-15后，ISG60基因的mRNA被大量的转录，由于细胞含有RNA、DNA和蛋白质等分子，需要从其中抽提出细胞总RNA，而ISG60 基因的mRNA就包含在细胞总RNA中。干扰素与细胞上的干扰素受体结合后，激活JAK-STAT信号通路，使STATl与STAT2异源二聚体、干扰素调节因子IRF9形成ISGF3的复合物，ISGF3 复合物进入细胞核，与细胞基因组上干扰素刺激应答元件ISRE结合，启动干扰素刺激基因的转录。用Trizol抽提诱导后的PK-15的总RNA。1Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总默其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。取干扰素刺激后的H(-15细胞，弃培养液，PBS洗涤3次，转移至 1. 5mL EP管，Trizol 600 μ L裂解，上下震荡混勻，室温静置lOmin。加入氯仿200 μ L，上下震荡20s混勻，室温静置:3min。4°C 12，OOOrpm离心lOmin，吸取500 μ L上层RNA溶液至新的EP管，加入500 μ L异丙醇，上下轻柔混勻，室温下或4°C静置lOmin。4°C 12，OOOrpm离心lOmin，弃掉上清，加入75%本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗廷荣，蔡新斌，孙石开，李晓宁，苏丽娟，尹珊，李晓泉，李延生，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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