本发明专利技术公开了大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，该重组蛋白的氨基酸序列由SEQ?ID?NO：7所定义。用大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白作用于Hep-2细胞，观察其大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞生长抑制效应，旨在揭示大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能，为抗癌蛋白药物的研发与抗癌机理的研究提供科学基础和资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于生物
技术介绍
哺乳动物的核糖体是由4种RNA和大约80个不同的蛋白质组成，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，小亚基核糖体蛋白命名为Sl至S31，大亚基核糖体蛋白命名为Ll至LA4。RPL23a蛋白是60s核糖体蛋白的组成部分，由rpl23a基因编码。目前，rpl23a基因在人类及部分动植物中的研究有报道，大熊猫的核糖体蛋白亚基S7、S12、S15、S20、S24、S28以及LSM3等基因的克隆与分析也有报道(罗晓燕等，2008 ；杜玉杰等，2009 ；郝彦泽等，2009 ；侯怡铃等，2009 ；张田等，2009 ；Hou W R et al.，2009 ；Zhang etal.，2009)，而大熊猫rpl23a基因及其RPL23a蛋白在国内外尚未见报道。尤其是大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能在国内外更无任何报道。大熊猫是我国特有珍稀物种，属国家一级保护动物，它具有极高的生态、科研、经济、文化和美学价值。国内外学者从不同角度和领域对大熊猫进行了大量的研究。目前，大熊猫功能基因的研究在国内外已成为研究的热点(汪晓晶等，2002;侯万儒等，2007 ；Hou WR et al.，2007 ；Hou Y L et al.，2009 ；Qiao et al.，2009 ；Xu et al.，2009 ；Wan et al.，2009 ；Tao et al.，2010)。
技术实现思路
本专利技术根据人(Homosapiens)、牛(Bos Taurus)、野猪(Sus scrofa)、、小家鼠(Mus mUSCUlUS)4个哺乳动物物种已知的序列设计引物，以大熊猫骨骼肌为材料，运用RT-PCR和PCR技术分别对大熊猫rpl23a基因的表达序列进行了扩增，克隆和测序；对其序列进行比较、分析，并且构建了含有rpl23acDNA的重组表达载体，转化进入E. coliBL21进行超表达；对超表达产物进行纯化获得大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白；用大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白作用于H印-2细胞，观察其大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞生长抑制效应，旨在揭示大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能，为抗癌蛋白药物的研发与抗癌机理的研究提供科学基础和资源。附图说明图1大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞生长的影响；(1-8 分别为 0，7. 4，2. 96,1.48,0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)；图2大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对H印-2细胞的形态影响；(1-8 分别为 0,7. 4,2. 96，1. 48，0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。1. 1材料和方法1. 1. 1材料及试剂大熊猫骨骼肌组织取自四川卧龙中国保护大熊猫研究中心死亡的大熊猫，为防止RNA降解，所取组织立即冻存于液氮中；人喉癌!fep-2细胞(购于川北医学院生化与分子免疫研究所)。总 RNA 抽提试剂盒 Total Tissue/cell RNA Extractiob Kits 购自 Waton公司；逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；T载体试剂盒(PMD-18T Vector Systems)及限制性内切酶Sma I，Pst I，SeaILEcoR I和Ml I均购自宝生物(大连)有限公司；Taqplus聚合酶购自上海生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。宿主菌E. coli Dffia由四川省野生动植物保护与利用重点实验室保存。CW0009 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京易莱西诺生物科技有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Mbchem M2031)购自上海美季生物技术有限公司；RPMI1640粉末购于Gibco公司(美国)，胎牛血清购于四季青生物制品公司，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司)。1.1. 2 方法1. 1. 2. 1 总 RNA 的提取取600mg左右的样品组织，液氮中充分研磨，按照抽提试剂盒说明书推荐的方法提取总RNA。将所提总RNA溶于经DEPC处理过的水中，于_70°C保存备用。1. 1. 2. 2 引物设计及 RT-PCR从GenBank 数据库中检索到人(NM_000984)、牛(ΝΜ_001045958)、野猪(AK233511)、小家鼠(NM_207523)4个哺乳动物物种RPL23a基因的编码区序列的相关信息，根据编码序列的保守性，利用I^rimer Premier 5. O软件设计上、下游引物(分别为Pd-RPL23a-F,Pd-RPL23a-R)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所设计引物编号及序列如下Pd-RPL23a-F 5' -CCTTTTCGAC AAGATGGCGC-3‘ (SEQ ID NO 1)Pd-RPL23a-R 5' -GAATTAGCCA GCTGGACTCA-3‘ (SEQ ID NO 2)以肌肉总RNA为模板，Oiligo (dT)为反转录引物，按逆转录试剂盒操作手册进行cDNA第1链的合成，反应总体积20 μ L，其中含总RNA lug, dNTPs ImM, MgCl25mM,0iligo(dT)15 0. 5 μ g，AMV 反转录酶 15U，RNA 酶抑制剂 IOU/μ L0 反转录条件:42°C 60min ；再以适量第1链产物为模板，采用25μ L PCR反应体系进行PCR扩增，各成分浓度为=MgCl21. 5Mm, dNTP 0. 2mM, Pd-RPL23a_F 和 Pd-RPL23a_R 各 0. 3 μ M，Taq plus 聚合酶 5U。反应条件94°C 5min，94°C lmin，52°C 0. 5min，72°C 1. 5min，32 个循环；72°C IOmin0 然后用质量分数为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并于_20°C保存。1. 1. 2. 3cDNA的克隆及鉴定对PCR产物进行回收纯化，用Sma I限制性内切酶酶切并平端化质粒pUC18片段，将回收产物与酶切并平端化后的质粒片段连接，22°C连接过夜。按常规方法转化感受态细胞，再涂于含氨苄青霉素、IPTG及x-gal的LB培养基上过夜培养，用接种针挑取5个白色菌落，碱裂解法提取质粒，采用双酶切(Pst I和ka II)和PCR这2种方法对重组质粒进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京华大生物科技发展有限公司测序。1.1. 2. 4 数据处理采用Genescan (http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)软件，对所克隆的基因序列进行氨基酸序列推定；采用ORF fi本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯万儒，侯怡铃，伍春莲，苏秀兰，孙冰，李俊，丁祥，王婷，
申请(专利权)人：西华师范大学，
类型：发明
国别省市：
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