肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所述；核苷酸序列如SEQIDNO.2所述；该重组蛋白可应用于制备单克隆抗体、多克隆抗体以及肠道病毒71型特异性抗体的检测。本发明专利技术为肠道病毒71型感染的血清学检测提供了一种新的诊断抗原，经实验证明本发明专利技术提供的肠道病毒71型特异性抗原具有良好的敏感性和特异性，可被肠道病毒71型感染后的人血清以及灭活全病毒动物免疫血清识别，不但可以用于肠道病毒71型感染的血清学诊断，还可以用于疫苗研发以及使用过程中的免疫效果评价。与全病毒颗粒作为诊断抗原相比，本发明专利技术提供的特异性蛋白抗原制备简便，降低了试剂盒制备的成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物医学的病毒免疫学检测
，具体涉及一种可特异性检测肠道病毒71型抗体的重组蛋白及该重组蛋白的应用。
技术介绍
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属小RNA病毒科、肠道病毒属，是手足口病的主要病原体之一。除EV71外，多种肠道病毒包括柯萨奇病毒A组0、5、9、10、16型)、柯萨奇病毒B组0、5型)和埃可病毒等也能引起手足口病，其中以柯萨奇病毒A16 (Coxsackie A16，CA16)最为常见。通常情况下，EV71感染引起的手足口病在临床症状和体征方面与CA16等其它肠道病毒所致的手足口病难以区别，但部分患儿也可出现无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等多种神经系统并发症，有较高的病死率和致残率，严重危害婴幼儿的生命健康。自1974年^^！！^肚等人首次报道EV71以来，EV71已在世界范围内引起多次暴发与流行。近年来，EV71感染疫情在亚太地区呈上升趋势，如1997年马来西亚、1998年我国台湾地区和1999年新加坡等地均出现暴发流行。2008年4月，我国安徽等较多省份相继出现暴发流行；据卫生部发布的法定传染病疫情报告显示，我国手足口病疫情呈逐年上升趋势。为有效控制EV71的流行，必须努力提高诊断和治疗水平、加强疫情监测与流行病学研究，发展有效的疫苗。其中早期特异性病原学诊断至关重要。早期诊断、早期治疗对于改善EV71型手足口病的预后、降低重症病例的病死率与致残率有重要意义。目前用于EV71感染的诊断仍以传统的病毒分离技术为主，然后用中和试验鉴定并确定血清型，或利用EV71单克隆抗体进行间接免疫荧光法(IFA)鉴定。这些方法费时费力且敏感性差，不利于早期诊断。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测EV71 RNA也是常见的方法，但由于其灵敏度很高，对实验室条件及操作人员要求也高，稍有不慎，极易引起交叉污染，出现假阳性，故难以在基层推广应用。而酶联免疫吸附试验(ELISA)由于其快速敏感且操作简单、无需太多的实验设备，适合在广大基层诊疗机构中推广应用。目前国内外EV71感染的ELISA检测，按所采用的抗原不同可以分为两大类。第一类是采用EV71灭活全病毒颗粒作为抗原来检测EV71特异性抗体。这一方法在实际应用中存在明显的不足一是利用纯化的EV71病毒颗粒做抗原，即使在纯度得到保证的情况下，病毒颗粒表面仍然存在一些与其他肠道病毒有交叉反应的抗原位点，故其特异性得不到保证。二是病毒培养和纯化过程不仅操作复杂、成本高，而且还易导致活病毒污染。第二类是采用VPl重组蛋白作为抗原来检测EV71特异性抗体。VPl是最主要的表面抗原，直接决定病毒的抗原性，但除了含有EV71型特异性抗原位点以外，也存在其他肠道病毒共同的抗原表位，可被其他肠道病毒感染血清识别，这些表位将在一定程度上降低EV71特异性抗体检测的敏感性和特异性。鉴于EV71的危害性以及目前血清学检测技术的一些缺陷，有必要开发一种EV71特异性抗原来替代上述诊断用抗原，以进一步提高EV71特异性抗体检测的敏感性和特异性。
技术实现思路
解决的技术问题目前在肠道病毒71型感染诊断中，采用病毒分离以及中和抗体检测等方法存在着费时费力又不能快速诊断的弊端，采用RT-PCR等分子生物学方法存在着过程繁琐又需要昂贵的分子生物学试剂及相应的仪器设备等问题，采用全病毒颗粒作为诊断抗原也存在着抗原制备过程复杂、费时费力、生物安全隐患等问题，为了解决上述问题，本专利技术提供了一种含有肠道病毒71型特异性抗原表位的重组蛋白及其制备方法，可以代替全病毒颗粒作为诊断抗原进行血清学诊断抗原，用于肠道病毒71型特异性抗体的检测。技术方案肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述。肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，表达该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所述。包含上述核苷酸序列的重组质粒。所述核苷酸序列的重组质粒为PGEX-4T-2/EV71-VP16_43> pGEX-4T-2/(EV71-VPl6_43)2、pGEX_4T_2/(EV7卜VP16_43) 4 禾口 pGEX_4T_2/(EV71-VP16_43)6。表达肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的工程菌株，宿主菌为大肠杆菌，它含有上述的重组质粒。肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的制备方法，以SEQ ID NO. 2所述的核苷酸为模板，设计上游引物SEQ ID N0.5和下游引物SEQ ID NO. 6，然后进行PCR扩增获得目的基因，经EcoRI和BamHI双酶切后克隆至表达质粒pGEX_4T_2，构建重组质粒pGEX_4T_2/EV71-VP 16_43 ；分别利用EcoR I和BamH I双酶切和EcoR I和BglII双酶切重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VPl6_43产生插入片段和载体，经T4 DNA连接酶连接形成含2个抗原编码基因片段的重组质粒PGEX-4T-2/ (EV71-VP16_43) 2，同法构建含4个和6个抗原编码基因片段的重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组工程菌；利用IPTG诱导表达重组蛋白并纯化获得目的蛋白。肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原在制备单克隆抗体、多克隆抗体以及在制备肠道病毒71型特异性抗体检测试剂盒中的应用。有益效果本专利技术为肠道病毒71型感染的血清学检测提供了一种新的诊断抗原，经实验证明本专利技术提供的肠道病毒71型特异性抗原具有良好的敏感性和特异性，可被肠道病毒71型感染后的人血清以及灭活全病毒动物免疫血清识别，不但可以用于肠道病毒71型感染的血清学诊断，还可以用于疫苗研发以及使用过程中的免疫效果评价。与全病毒颗粒作为诊断抗原相比，本专利技术提供的特异性抗原蛋白制备简便，降低了试剂盒制备的成本。附图说明图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中A为EV71-VP1基因扩增，B为EV71-VP16_43 区段扩增；图2为表达质粒pGEX-4T-2/EV71_VPl6_43的构建流程图；图3为SDS-PAGE分析GST_EV71_VP16_43重组蛋白诱导表达情况，其中M表示蛋白分子量标准，1为诱导前，2-12为各菌落诱导池；图4为flfestern-blot分析GST_EV71_VP16_43重组蛋白的免疫反应性，其中图4A是重组蛋白与EV71等相关病毒兔免疫血清IgG的反应性分析，其中1-3是抗EV71兔血清，4是抗CA16兔免疫血清，5是抗Echo6兔免疫血清；图4B是重组蛋白与手足口病患者血清IgM的反应性分析，1-13为EV71阳性血清(PCR)，14-16为CA16阳性血清(PCR)，17-18为EV71和CA16双阴性血清(PCR)；图5为EV71_VP16_43多拷贝重组蛋白抗原的表达及免疫反应性比较。其中图5A为SDS-PAGE分析串联表达的GST重组蛋白纯化情况，其中M表示蛋白分子量标准，1为GST, 2-5分别为含EV71-VP16_43不同拷贝数的GST重组蛋白；B和C :ffestern-blot分析EV71-VP16_43不同拷贝数GST-重组蛋白与EV71感染患者血清IgM的免疫反应性比较，图5B为EV71本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟继鸿，张建华，董敏，江炳福，徐明杰，程险峰，董晨，戴星，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：
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