鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因、该基因的克隆方法及其应用。本发明专利技术鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示，所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本发明专利技术以鱼腥蓝细菌的总DNA为模板，利用上下游引物扩增得到2-酮基-肌醇脱氢酶编码基因。该基因在光合模式生物蓝细菌中进行超量表达，能够显著提高转基因菌株对除草剂百草枯的抗性，揭示了该基因在构建抗除草剂转基因植物中的广阔运用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鱼腥蓝細菌基因工程
，具体涉及鱼腥蓝細菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，本专利技术还涉及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。
技术介绍
杂草控制是农业生产管理中的重要环节。传统的杂草控制主要通过不断耕耘及人 エ除草进行。上个世纪四十年代，随着对杂草的化学控制技术的深入发展，一系列用于杂草控制的化学除草剂开始大量出现。目前应用最广泛的除草剂包括苯氧羧酸类的ニ四滴及其衍生物；苯甲酸类如百草敌等；有机磷类如草甘膦及其衍生物；联吡啶类如百草枯等。抗除草剂转基因作物通过增加作物对特定除草剂的耐受能力，能够一次性高效杀灭杂草，进行无耕种植，减少水土流失；尤其在草坪エ业、育种育苗领域有着传统除草剂难以比拟的优势。同时抗除草剂作物也能极大减轻除草剂本身对于作物的影响，增加农业产量。世界上第一个抗除草剂转基因作物是1996年美国出现的抗草甘膦转基因大豆，此后抗除草剂转基因油菜、棉花、玉米、甜菜、苜蓿等陆续推出商用种植。抗除草剂转基因作物的物质基础是抗除草剂的基因资源的分离和运用。以抗草甘膦为例，目前已经运用的主要有超表达EPSPs (5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)或超表达草甘膦氧化酶和草甘膦N-乙酰转移酶来解除草甘膦对作物的毒性等。目前商品化最为广泛的是美国孟山都公司所拥有的Roundup Ready作物。目前全球已经有超过50个抗除草剂转基因作物进行了商业种植，主要的除草剂与抗性基因搭配为草甘膦一CP^psps，草丁膦-pat或者bar，辛酰卤苯腈-—bxn，磺酰脲类-surB。“百草枯”又名“克无踪”，是世界上用量第二大的除草剤，仅次于草甘膦。它具有非选择性和触杀特性，因此被广泛用于农业和园艺除草以及棉花、大豆等的催枯。百草枯的作用机理是通过干扰光合植物的光合反应中心I(PSI)附件的电子传递，并介导生成活性氧(Reactive oxygen species)组分，对细胞产生致死效应。目前认为細胞主要通过增加对百草枯的外排能力或者降低其吸收能力来降低細胞内的百草枯浓度，从而提升对环境百草枯的抗性。目前尚无抗百草枯转基因作物的报道。涉及百草枯抗性的相关基因主要是ー 些编码ABC型转运子的基因如大肠杆菌的emrB、emrE等(Prosecka, Orlov et al. 2009)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来自鱼腥蓝細菌的2-酮基-肌醇脱氢酶基因，以及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的一种鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，该基因是由1116个核苷酸組成，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。上述鱼腥蓝細菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因所编码的多肽，由371个氨基酸組成， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。多肽的分子量大小约为41. 22千道尔顿(kDa)。上述鱼腥蓝細菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆方法包括以下步骤(1)分离鱼腥蓝细菌总DNA ；(2)根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物上游引物为 GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG ；下游引物为 GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入NdeI和B10I核酸内切酶酶切位点；(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物；(4)回收 PCR 产物；(5)将PCR产物利用NdeI和)(hoi核酸内切酶连入克隆载体pBSpetE中，构建重组质粒；(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化。该基因在光合模式生物蓝细菌中进行超量表达，能够显著提高转基因菌株对除草剂百草枯的抗性，掲示了该基因在构建抗除草剂转基因植物中的广阔应用前景。利用本专利技术所构建的转基因光合细菌对除草剂百草枯的抗性得到显著提高，这为开展抗除草剂转基因作物提供了新的候选基因资源。附图说明图1 是本专利技术实施例中构建克隆载体pBSpetE1580和超表达载体 pRL25TpetE1580 的示意图；图2 是本专利技术实施例分离转基因蓝细菌中的重组质粒的酶切后的凝胶电泳图；Μ:是分子量标准；1 重组质粒经过NotI和B10I双酶切的琼脂糖凝胶电泳結果。图3 是本专利技术实施例中转基因蓝细菌对百草枯抗性测试的直观图；图4 是本专利技术实施例中转基因蓝细菌对百草枯抗性的统计图。具体实施方案以下是结合附图和实施例对本专利技术作的进ー步阐述。需要说明的是，本专利技术的实施例对于本专利技术只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均參考《分子克隆实验指南》所描述的内容(參见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。实施例1鱼腥蓝細菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆以鱼腥蓝细菌的总DNA为模板，扩增得到2-酮基-肌醇脱氢酶编码基因(申请人将其命名为1580，下同)。将1580基因连接入克隆载体pBSpetE中，然后进行测序和序列分析，具体步骤为(1)鱼腥蓝细菌总DNA的分离离心收集约20mL的蓝细菌菌体，加入400 μ L TE 缓冲液(pH7.5)，150yL 的玻璃珠(Sigma G-9143)，20 μ LlO % 的 SDS，以及 450 μ L 苯酚 /氯仿(1 1)混合物，全速振荡三次，毎次lmin，毎次间隔放置在冰上冷却，然后全速 (13，OOOrpm)离心混合物1分钟，取上清，用等体积的苯酚/氯仿(1 1)反复抽提，直至苯酚/氯仿交界处看不到变性的蛋白质，取上清，加入1/10体积的3M NaAc,混合，再加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，混合，全速(13，OOOrpm)离心5min，加入70%乙醇洗涤一次，沉淀干燥，最后溶于50 μ L水中，利用紫外分光光度计进行DNA浓度测量，在-20°C保存备用；( 根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物上游引物为 GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG ；下游引物为 GCCctcgagGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入NdeI和B10I核酸内切酶酶切位点；(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用与上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。 扩增反应的具体条件为利用高保真PCR试剂盒，加入终浓度为lpmol/μ L的上下游引物； 25pmol/μ L的dNTP，25pmol/μ L的Mg2+及试剂盒所附帯的相关反应缓冲液和DNA聚合酶； 混勻以后，将反应管置于PCR仪上，按照下列程序进行PCR反应95°C预变性5分钟；95°C 预变性30秒，57°C预变性45秒，68°C预变性1分钟，进行25个循环；68°C 5分钟，4°C 5分钟；(4)回收PCR产物采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物；(5)如图1所示，将PCR产物利用Nde I和)(ho I核酸限制性内切酶连入克隆载体 PBSpetE中，构建具有氨苄青霉素抗性的重组质粒pBSpetE1580 ；(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化用pBSpetE1580转化大肠杆菌 E. coli TG1，并涂布在氨苄青霉素抗性平板(Ampr，终浓度为lOOug/ml)。将抗性平板置于 37°C培养箱中培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雯莉，汪方奎，支遥，王莉，张巨源，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：