本发明专利技术公开一种Cav-1低表达的SMMC-7721KD细胞系的构建方法。具体采用Cav-1SiRNA干扰技术构建Cav-1稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系。经过设计引物、扩增目的片段，构建Cav-1SiRNA重组质粒，进行质粒转染，然后对转染后的细胞进行博莱霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系，最终获得阳性重组细胞系，能够沉默SMMC-7721细胞中Cav-1的表达80％左右，并且Cav-1稳定低表达。Cav-1稳定低表达的SMMC-7721细胞系可作为模型，进行Cav-1参与的一些肿瘤细胞的研究，Cav-1与肝癌的相关性及其机理研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到细胞生物学技术，具体涉及一种采用Cav-ISiRNA干扰技术构建Cav-I稳定低表达的SMMC-7721细胞系的方法。
技术介绍
窖蛋白(Caveolin)是构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白，由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-I(Cav-I)基因是Caveolin基因家族的成员之一，是caveolae的主要结构成分，参与许多细胞过程调节，包括细胞信号传导的调控等。在乳腺癌中，Cav-I与ERa 36相互作用调节的膜起始雌激素信号通路可以控制乳腺细胞转化；在神经细胞中，Cav-I蛋白与动物发育和学习记忆密切相关，可能参与中枢可塑性的调节。Cav-I在一定时期分化的成纤维细胞，脂肪细胞，内皮细胞中高度表达。有证据证明Cav-I在成纤维细胞中扮演着肿瘤抑制器的角色。肿瘤的发生是一个长期的、分阶段的、多种基因参与的复杂过程。众多研究表明Cav-I在正常组织中高表达，而在乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌和结肠癌中表达明显下降，在甲状腺滤泡状癌中甚至无表达。但同时也有研究发现Cav-I在某些肿瘤组织中呈高表达，如Yang等研究发现在大鼠正常前列腺上皮细胞中Cav-I表达微弱；在原发性前列腺癌细胞中其表达加强。相关文献显示Cav-I是肝再生所必需的蛋白质，在脂滴和新生细胞膜的形成中发挥着重要作用。肝细胞中的Cav-I可能同样参与细胞的增殖调控及癌变过程。由此可见Cav-I与肿瘤的发生、发展、临床表现及治疗均有关系。但目前有关Cav-I在肝癌细胞中的作用及其机制尚未完全阐明。原因之一可能是肝癌细胞中内源性的Cav-I具有干扰作用。因此消除内源性的Cav-I的干扰将会为研究Cav-I在肝癌中的作用创造有利条件。已有文献报道的Cav-I低表达的肝癌细胞有两个来源。一种是通过构建人Cav-IRNA干扰慢病毒载体的方式转染人肝癌细胞株SMMC-7721，稳定转染SMMC-77215天后，对其Cav-ImRNA表达水平的敲除率达90%。另一种是通过脂质体介导的Cav-I反义寡核苷酸瞬时转染SMMC-7721细胞。但至今为止，在人肝癌细胞中尚未见到用siRNA干扰转染质粒的方法通过药物筛选使Cav-I基因沉默的报道。原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内发病率居所有恶性肿瘤第五位，死亡率居第三位，全世界每年新发肝癌中42%出现在我国大陆。因此更好地建立一系列人肝癌细胞系将会为肝癌发病机理的研究和临床治疗提供必要的基础。RNA干扰技术是近年来快速发展起来的一项基因沉默技术，RNA干扰也成转录后基因沉默，是由双链RNAWouble-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。它的出现为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗方面都提供了一种新的研究手段，与传统的反义核酸，基因剔除等技术相比，具有特异性强，针对性强，级联放大等优点。它将会成为攻克肿瘤、心血管病、传染性疾病等疑难顽症最锐利的武器。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种Cav-I低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法。本专利技术采用Cav-ISiRNA干扰技术构建Cav-I稳定低表达的SMMC-7721细胞系，即SMMC-7721KD细胞系。SMMC-7721细胞购自于中国科学院上海细胞库，它来自于一位50岁男性肝癌患者，由第二军医大学董荣春等人建立，贴壁生长，属上皮细胞，具有致瘤性，该细胞的Cav-I表达很1 OCav-I是细胞膜上重要的信号转导因子，对膜上多种生长因子受体和信号通路起调节作用，参与细胞的生长、分化、增殖和肿瘤发生的生理和病理过程。构建Cav-ISiRNA的psiRNA-CAVl干扰质粒，并进行质粒转染SMMC-7721细胞，然后对转染后的细胞进行博莱霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系，沉默SMMC-7721细胞中Cav-I的表达80%左右，并且Cav-I稳定低表达。SMMC-7721KD细胞系可作为模型，进行Cav-I参与的一些肿瘤细胞的研究，Cav-I与肝癌的相关性及其机理研究。本专利技术通过下述技术方案实现本专利技术的一方面在于Cav-l稳定低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法，包括如下步骤(a)设计对应Cav-I基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)构建含有上述碱基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 psiRNA-hHlzeo G2重组质粒；(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC-7721得到的重组细胞株；(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过kocin筛选培养基培养，细胞M小时一次换液，四天传代1次，传至第七代时，Cav-I稳定低表达，第八代细胞扩大培养，并冻存细胞，获得阳性克隆细胞系；其中，上述Wkocin筛选培养基为RPMI-1640培养基加10%新生牛血清，再加 100ug/L Zeocin ；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法和/或X射线照射联合平板克隆形成实验法检测。在上述的构建方法中，步骤(b)所述的构建方法包括如下步骤(f)将转录模板核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷却至35°C得到退火产物；(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与对质粒psiRNA-hHlzeo G2进行Bbs I酶切后的线性化载体在16°C连接，过夜；(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E. coli DH5a后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO :3。本专利技术的另一方面在于利用上述构建方法所获得的Cav-I稳定低表达的SMMC-7721 细胞系。附图说明图1 为载体psiRNA-CAVl的酶切图。其中A为psiRNA-CAVl电泳图，M代表DL2000marker ； 1代表psiRNA-CAVl质粒；B为质粒酶切之后的电泳图，1为环状质粒，2为使用I^st I产生的线性质S^^bp ;3为使用I^st I和EcoR V酶切之后产生的两个片段大约为 1265bp 和 1363bp。图2 为细胞转染后第3代，第5代，第6代，第7代，细胞中Cav-I表达下调的western blot结果图；其中上图为Cav-I和β -actin的western blot结果经X光医学胶片感光图，C代表SMMC-7721对照，3、5、6、7代表SMMC-7721KD传代的代数；下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β -Actin为内参)。图3 为瞬时转染Cav-IsiRNA质粒，SMMC-7721细胞中Cav-I的表达下降的western blot结果图；其中上图为SMMC-7721对照细胞和SMMC-7721KD细胞经westernblot，Cav-I和β-actin X光医学胶片感光图，下图为对胶片进行计算机扫描定量分析，用扫描仪和凝胶成像系记录相应条带的透射光积分吸光度值(IOD)，反映样品的蛋白量。(β-Actin 为内参)。图4 为X射线照射之后S本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹伟，刘艳，王洋，史丹，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：
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