一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法技术

本发明专利技术公开了一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，包括以下步骤：1)配制待转染的电穿孔溶液；2)对胚胎透明带进行弱化处理；3)将胚胎移入配制好的含电穿孔溶液，室温静置，然后再将胚胎连同电穿孔溶液移入电转槽中进行电穿孔。由于采用了电穿孔转染的方法，本发明专利技术还能同时将两种或多种质粒DNA，或者反义寡核苷酸一起转入附植前胚胎，如果构建的质粒DNA所携带的外源片段是某个关键基因或靶向某个关键基因的干扰片段，则可具体研究某个关键基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于胚胎转染领域，涉及一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法。
技术介绍
哺乳动物早期胚胎发育由其自身的遗传机制所控制，研究该遗传机制所采用的基本方法是调控关键基因的表达，观察后续的发育情况并分析该关键基因在发育过程中所发挥的作用。目前，将外源基因导入胚胎进行过表达或抑制基因的表达是研究基因功能一贯且经典的方法。把外源基因转入到细胞/胚胎或整合到基因组主要通过转染、病毒载体的感染和显微注射，而抑制基因的表达主要依靠基因敲低和基因敲除技术。然而，就附植前胚胎而言，通过转染或病毒载体的感染而把外源基因导入十分困难，因为附植前胚胎外面由一层透明带包裹。基因敲除技术虽好但不能广泛的应用，因为此技术费时费力且花费巨大。目前外源基因和下调基因表达的序列包括dsRNA、siRNA以及反义寡核苷酸主要通过显微注射导入附植前胚胎。此种方法效率很低，因为将外源基因和dsRNA、siRNA以及反义寡核苷酸导入2-细胞期以后的附植前胚胎需要逐个卵裂球的注射，费时费力且每次只能操作一个胚胎。抑制基因表达的方法根据原理不同大致可分为两类：第一，利用siRNA或dsRNA降解靶mRNA，使关键基因失去翻译的模板；第二，利用反义寡核苷酸与靶mRNA进行结合，要么抑制靶mRNA的翻译，要么改变靶mRNA的剪切，进而表现出某关键基因失活的表型。以前，抑制基因的表达时，运用最多的是siRNA和dsRNA，但最近几年，反义寡核苷酸的运用有上升的趋势，因为反义寡核苷酸不降解靶mRNA且不易被RNase H降解，在细胞或胚胎内能维持较长时间。目前，发育生物学家多采用显微注射的方法将反义寡核苷酸注入卵子或者斑马鱼、青蛙、海鞘、海胆等的受精卵中进而研究胚胎发育。此方法能准确控制反义寡核苷酸的导入时间，但该方法对操作人员的技术要求很高，且每次只能注射一个胚胎，效率很低因此，亟待寻求一种将外源基因或特异序列快速高效导入小鼠附植前胚胎的方法，为进一步深入研究小鼠早期胚胎发育机理提供技术支持。电穿孔技术主要是利用瞬时的脉冲电场改变细胞膜脂质双层的结构，使细胞膜形成暂时性的孔洞，大分子在电场的作用下进入细胞或胚胎。在成功的电转中，电通透作用和电泳作用起着非常关键的作用，此外，大分子的被动扩散和细胞内吞也起了一定的作用。而利用电穿孔技术将质粒DNA或反义寡核苷酸导入附植前胚胎的报道至今未见。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，实现对胚胎进行安全、简便、高效的转染。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，包括以下步骤：1)将待转染的质粒DNA用电转缓冲液稀释至浓度为10～80μg/ml，得到质粒DNA电穿孔溶液；或者将待转染的反义寡核苷酸用电转缓冲液稀释至浓度为0.2mM，得到反义寡核苷酸电穿孔溶液；2)将待转染的附植前胚胎置于酸性台氏液中，室温孵育10～20s，然后终止消化并清洗；3)将质粒DNA电穿孔溶液或反义寡核苷酸电穿孔溶液加入电转皿两根电极之间的凹槽中，将附植前胚胎线性排列在电转皿的两根电极之间，在脉冲电场下，利用电穿孔法对附植前胚胎进行转染。所述的质粒DNA在转染前还进行去内毒素处理，将去内毒素处理的质粒DNA用电转缓冲液进行稀释。所述的将附植前胚胎在进行酸性台氏液处理之前，还对胚胎用H-KSOM溶液清洗。所述的终止消化是将胚胎从酸性台氏液转移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用溶液清洗。所述的转染的质粒DNA为带有荧光基因的质粒DNA；所述的反义寡核苷酸在转染前还进行lissamine标记，将lissamine标记的反义寡核苷酸用电转缓冲液进行稀释。所述的转染的质粒DNA包括一种或多种以上序列不同的质粒DNA。所述的附植前胚胎包括处于不同发育时期的附植前胚胎。所述的电穿孔法进行质粒DNA转染的参数控制为：电压20V～40V；脉冲时间1～2ms；脉冲次数3～4次。所述的附植前胚胎为小鼠附植前胚胎，电转参数控制为：电压20V～40V；脉冲时间1～2ms；脉冲次数3～4次。所述的电穿孔完成后，将转染后的胚胎清洗并转移入KSOMaa培养液中培养。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术提供的质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，首先对胚胎透明带结构使用台氏液进行弱化处理，然后再将处理后的胚胎置于脉冲电场作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔，导致其通透性和膜电导瞬时增大，可以使在正常生理情况下细胞膜难以通透的质粒DNA或反义寡核苷酸进入细胞。由于采用了电穿孔转染的方法，本专利技术还能同时将两种或多种质粒DNA一起转入附植前胚胎，如果构建的质粒DNA所携带的外源片段是某个关键基因或靶向某个关键基因的干扰片段，则可具体研究某个关键基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。由于采用了电穿孔转染的方法，本专利技术能将所设计的、与不同靶基因的mRNA结合的反义寡核苷酸转染到胚胎内，可用于研究目的基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。为了进一步观察或跟踪转染效果，待转染的质粒DNA带有荧光基因，而待转染的反义寡核苷酸进行lissamine(丽丝胺，可以发红色荧光)标记，这样在电穿孔转染后通过荧光显微镜可以直观的观察。本专利技术将质粒DNA或反义寡核苷酸转入附植前胚胎省时、省力、花费少、操作简单、对操作者以及操作的胚胎没有毒性、效率高、速度快。一次可操作50～100枚胚胎，电转时间在1min以内。电转后体外培养24h，通过荧光显微镜对胚胎进行观察并进行统计学分析表明，本专利技术的电转效率约为97％。为采用质粒DNA或反义寡核苷酸所针对的基因或基因转录物研究其在胚胎中的功能提供了有效的转染方法。附图说明图1为质粒DNA转入不同发育时期附植前胚胎的显微照片；图2为反义寡核苷酸转入不同发育时期附植前胚胎的显微照片。具体实施方式附植前胚胎的发育主要经历三次转变(分别为合子基因组激活、致密化和囊胚形成)和两次谱系分化(滋养外胚层和内细胞团的分化、内细胞团分化为原始内胚层和外胚层)。每次转变或谱系分化都伴随着胚胎基因表达的巨大变化，因此，研究胚胎在转变或谱系分化过程中表达变化比较大的基因能进一步的揭示早期胚胎发育所蕴藏的分子调控机制。然而，目前常用的技术在研究基因功本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1)将待转染的质粒DNA用电转缓冲液稀释至浓度为10～80μg/ml，得
到质粒DNA电穿孔溶液；
或者将待转染的反义寡核苷酸用电转缓冲液稀释至浓度为0.2mM，得到
反义寡核苷酸电穿孔溶液；
2)将待转染的附植前胚胎置于酸性台氏液中，室温孵育10～20s，然后
终止消化并清洗；
3)将质粒DNA电穿孔溶液或反义寡核苷酸电穿孔溶液加入电转皿两根
电极之间的凹槽中，将附植前胚胎线性排列在电转皿的两根电极之间，在脉
冲电场下，利用电穿孔法对附植前胚胎进行转染。
2.如权利要求1所述的质粒DNA转染附植前胚胎的方法，其特征在于，
所述的质粒DNA在转染前还进行去内毒素处理，将去内毒素处理的质粒
DNA用电转缓冲液进行稀释。
3.如权利要求1所述的质粒DNA转染附植前胚胎的方法，其特征在于，
所述的将附植前胚胎在进行酸性台氏液处理之前，还对胚胎用H-KSOM溶液
清洗。
4.如权利要求1所述的质粒DNA转染附植前胚胎的方法，其特征在于，
所述的终止消化是将胚胎从酸性台氏液转移到H-KSOM溶液中清洗，然后再
用溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭辉，张涌，常博皞，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：