检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法技术

本发明专利技术提供一种检测人体CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于：该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段，然后利用传统的RT-PCR基因扩增技术，对上述CW9甲基化非阴性产品的样品进行检验，然后根据化学发光免疫技术及RT-PCR的检验结果对患者是否有早期直肠癌进行综合性的评定，以及进行各种的癌症筛查与检验。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学检验领域，尤其设计ー种。
技术介绍
我国肿瘤的诊断主要依靠影像学手段，其缺点是不能早期诊断。一旦发现影像学异常，多数病例已错过手术治疗甚至化学药物和放射治疗的时机。因此，借助免疫检测肿瘤标志物进行早期诊断始终是肿瘤防治研究的重要课题。但现有试剂盒检测结果与疾病的符合率还不理想。对许多病例不能做出准确早期诊断。目前市场上用于免疫检测肿瘤标志物的主要有放射免疫和酶免疫两大类试剂盒。虽然它们都通过定量分析病人体内的肿瘤标志物表现提出诊断信息，但是存在以下几方面的问题a.定量标准混乱，不同厂家生产的试剂盒定量ー个特定样品的结果有时会相差数倍， 导致特定标志物表达的信息无法准确传递出来，与疾病的符合程度下降；b.定量范围不合理。普遍表现为定量范围窄，在实际应用中给定量的准确性带来影响。 因而，新型检测技术精确定量分析肿瘤标志物，可以准确区别个体分度和疾病状态下肿瘤标志物水平的差异及浓度变化。而化学发光免疫诊断技术由于灵敏度高，线性范围宽，从而在有种于确定合理的定量和定量范围。结肠镜检查是目前临床使用的最精确的结肠癌筛检方法，但是，高额的费用和患者不愿承受这种侵入性治疗方法限制了它的使用。结肠癌发生时，关联相关基因CW9出现甲基化，然后利用RT-PCR技术进行片段扩増，基因检测，或者而采用其他的方法进行检測， 但对于在片段扩增前的基因CW9甲基化的早期检测方法效果并不理想。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种，其目的是解决以往的检测方法效果不理想的问题。技术方案本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种，其特征在于该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段。单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法的具体步骤如下 (1)、制备单克隆抗体单克隆抗体利用下列试剂抗原CW9基因CpG岛甲基化片段为阳性抗原，CW9基因CpG岛非甲基化片段为阴性抗原，非特异性抗原为=MGMT基因CpG岛甲基化片段，P16基因CpG岛甲基化片段，HPPl基因CpG岛甲基化片段；其它特殊试剂弗氏完全佐计与弗氏不完全佐计，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，邻苯ニ胺，TRIS，HEPES缓冲剂，辣根过氧化氢酶标兔抗BALB/c鼠检验试剂盒其他常规化学试剂均为分析纯试剂；免疫动物8周龄BALB/c雄性小鼠用阳性抗原甲基化CW9/CpG进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100μ g，腹腔注射；24d后加强免疫，剂量为每只小鼠100μ g，尾静脉注射，4d后取脾融合；細胞融合免疫小鼠脾细胞与骨髄瘤細胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量为1000 聚乙ニ醇作融合剂，融合細胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%C02，37°C条件下培养，7d后，每培养孔更换 2/3HT培养液。9d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的細胞立即用有限稀释法进行克隆化； 腹水抗体纯化用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体； (2)、CW9甲基化片段免疫化学发光法測定a.化学发光系统的优化由SapphireII不同浓度的增强剂和成底物工作液，进行化学发光值測定，进行底物工作液的优化；b.固相化抗体微孔板的制备将上述制备的抗CW9甲基化片段单克隆抗体用0.05 mol/L、pH 为 9. 6 的碳酸盐缓冲液稀释成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被浓度，按100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、pH为7. 4的PBS 37°C封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度；c.以正常人游离DNA作为參考，确定用优化好的HRP化学发光定量试剂对100份健康人标本进行浓度測定，进行统计学分析，确定正常游离DNA，CW9甲基化片段參考范围；d.化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加25μ L后，每孔再各加第二抗体 75 yL，在震荡器上混勻1 min，置37°C恒温反应60 min.洗掉游离成分，加入底物工作液 50 yL，催化底物，第10 min后測定各加样品孔的发光值RLU，并将数据用化学发光检测仪Luminoskan Ascent version 2. 4. 1tfi^lf。将制备的单克隆抗体进行杂交瘤筛选及抗体检测，具体步骤如下杂交瘤筛选用固相抗原间接竞争性ELISA法进行包被阳性抗原甲基化CW9/CpG的浓度为25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗体抗原反应物由80 μ 1培养上清液+2 μ 1 经紫外分光光度计标定浓度的15 μ g/ml的甲基化CW9/CpG組成；检测对照孔中的抗原部分则用20μ l、20%Me0H-PBS的抗原稀释液代替；酶底物用邻苯ニ胺；其它按标准方法进行。优点及效果本专利技术提供一种，其特征在于该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段。本专利技术通过化学发光免疫技木，定性地測定特定的肿瘤基因甲基化片段。本专利技术的关键在于制备CW9甲基化单克隆抗体，该抗体可以对CW9甲基化片段有阳性反应，对CW9 非甲基化有阴性反应。以上得出一个中间結果，然后利用传统的RT-PCR基因扩增技术，对上述CW9甲基化非阴性产品的样品进行检验，然后根据化学发光免疫技术及RT-PCR的检验结果对患者是否有早期直肠癌进行综合性的评定。本专利技术具有如下的优点 1、化学发光免疫检测化学发光免疫分析方法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)因其具有简便易5行、标记物制备非常容易、稳定性高、便于实现完全自动化和不污染环境等优点，特别是能在较短的时间内得到实验結果，因此深受检验医学工作者和临床医师的好评。化学发光免疫诊断试剂作为免疫诊断试剂的ー种，是以化学发光免疫检测技术为基础的ー类诊断试剂，理论上所有免疫反应均可以制备为化学发光诊断试剂盒。此类试剂盒通常包括免疫反应试剂及化学发光反应试剂。2、化学发光免疫方法的特点作为近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析方法。基于此构建的化学发光免疫诊断试剂具有以下突出的技术特点①灵敏度高。以发光底物可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5000倍。这对浓度极稀的临床标志物的检测尤为有效。以当前广为关注的HIV诊断为例。Handa等医用化学发光免疫分析法检测处于窗ロ期的HIV-I PM抗原。发现化学发光法的最小检测极限在3. 1-6. 3pg/ml之间，而酶免疫法的最小检测极限在12. 5-25. 0 pg/mL之间。与酶免疫法相比，化学发光法可把HIV的窗ロ期缩短7d。Sakai等医用化学发光免疫技术检测pM 抗原。其最小检测浓度达到4. 3 pg/mL,小于Abbot和Coulter酶免疫试剂盒的相应浓度。 缩短了 HIV感染的窗ロ期。②宽的线性动力学范围，发光强度在4-6个数量级之间与測定物质浓度间呈线性关系，这有助于检测浓度较高的临床样本。并避免弯钩效应，便如化学发光免疫分析检测癌胚抗原(CEA)时的线性范围为0. 01-1000 ng/mL，达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于该方法通过单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法进行检测CW9基因中的CpG甲基化片段。2.根据权利要求1所述的检测CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于单克隆抗体和化学发光试剂联用的方法的具体步骤如下(1)、制备单克隆抗体单克隆抗体利用下列试剂抗原CW9基因CpG岛甲基化片段为阳性抗原，CW9基因CpG岛非甲基化片段为阴性抗原，非特异性抗原为=MGMT基因CpG岛甲基化片段，P16基因CpG岛甲基化片段，HPPl基因CpG岛甲基化片段；其它特殊试剂弗氏完全佐计与弗氏不完全佐计，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，邻苯ニ胺，TRIS，HEPES缓冲剂，辣根过氧化氢酶标兔抗BALB/c鼠检验试剂盒其他常规化学试剂均为分析纯试剂；免疫动物8周龄BALB/c雄性小鼠用阳性抗原甲基化CW9/CpG进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100 μ g，腹腔注射；24d后加强免疫，剂量为每只小鼠100 μ g，尾静脉注射，4d后取脾融合；細胞融合免疫小鼠脾细胞与骨髄瘤細胞Sp-2 / 0以10:1混合；用50%分子量为1000 聚乙ニ醇作融合剂，融合細胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%C02，37°C条件下培养，7d后，每培养孔更换 2/3HT培养液；9d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的細胞立即用有限稀释法进行克隆化；腹水抗体纯化用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体；(2)、CW9甲基化片段免疫化学发光法測定a.化学发光系统的优化由SapphireII不同浓度的增强剂和成底物工作液，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾世哲，程澎，孙琦，
申请(专利权)人：程澎，孙琦，
类型：发明
国别省市：