本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与各种癌症早期病理演变有密切相关microRNA-372的方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测microRNA-372和microRNA-372表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期RNA水平筛查，同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与各种癌症病理演变RNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近 210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400 多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患者，每年的花费是1. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本专利技术的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对 1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本专利技术人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以 2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本专利技术采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、正常对照)，对MICR0RNA-372基因与各种癌症的早期预警进行检测分析。微小核糖核酸(microRNA/miRNA)是一段长度约为22核苷酸的寡核醣核酸分子， 它们可以藉由调控mRNA来抑制转译作用或是造成mRNA的解低基因的表现。近来有许多研究发现，miRNA与癌症具有高度的相关性。因此推论miRNA可能是癌化过程的一个导因。到目前为止，在人体上有超过700个miRNA被发现，而大约有100左右的miRNA被确认与人类癌症具有相关性，这其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、脑癌、肝癌、直肠结肠癌、 胶质细胞瘤、垂体瘤等多种肿瘤在食道癌细胞中，我们发现抑癌蛋白质-LATS2的表现受到 miR-373所抑制并且在食道癌细胞株与食道癌临床组织中，LATS2与miR-373的表现有相反的趋势。我们也发现在食道癌细胞中抑制或过度表现miR-373，细胞的生长会受到影响。 综合上述结果，我们发现miR-330和miR-373均可以透过调控其target proteins来影响食道癌细胞的生长。另外，此研究也提供将来在临床上治疗食道癌的新方向。这一种内源性的小分子RNAs虽然目前不断有新的成员被发现，但是只有很少的miRNAs功能被确定，荷兰癌症研究院的P. Mathijs Voorhoeve等人为了进一步确定miRNAs的功能构建了一个人类大部分miRNAs载体克隆表达文库，获得了相应的 DNA barcode arrays。再通过与细胞致癌基因相关miRNA的筛选，研究人员辨认了两个miRNAs-miR-372和miR-373，这两个miRNAs是定位在致癌基因RAS和活性野生型p53的初始细胞癌变和肿瘤化的关键因子。而且研究人员也发现这些miRNAs也抑制了 p53介导的CDK抑制因子的作用，这个作用可能是通过直接阻止肿瘤抑制因子LATS2的表达。这些都证明了 miRNAs是一种可以通过抑制p53途径促进人类生殖细胞肿瘤生成的新的一种致癌基因。本专利技术人在研究中发现microRNA-372在各种癌症患者(特别是食道癌)、癌症高危人群、正常对照人有明显的表达量变化，将microRNA-372作为早期筛查各种癌症变前期有非常重要的临床诊断意义。MICR0RNA-372在各种癌症变前期(特别是食道癌)及癌变过程中高表达。他作于癌变前期筛查、及各种癌症治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。专利技术人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，专利技术人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。目前对MICR0RNA-372的研究都采用高通量基因芯片分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(mRNA与蛋白转录有时候不同步)。根据现有的文献资料MicroRNA-372水平的检测技术及试剂盒未见报道。本专利技术人在针对创新性专利技术的要求，设计了(癌症患者、高危人群、正常对照)不同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上癌症症病人MICR0RNA-372高表达，高危人群有不同程度表达15-2596，正常对照都是低表达。表明MICR0RNA-372为癌症病变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，裘霖，张玉丽，
申请(专利权)人：苏州福英基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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