本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法。本发明专利技术的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌BA205，其保藏号登记号为CCTCCNO：M2011447。其构建过程主要以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶后，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及，具体是一株高效利用葡萄糖生长并产丁二酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。
技术介绍
丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ - 丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBQ类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来 12种最有价值的生物炼制产品之一。丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2,能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Armerobiospirillum succiniciproducens^Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、 重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。 E. coli由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶 (如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶)、增强丁二酸合成途径中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源导入可以弓I导合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其对葡萄糖的利用率以及生产速率。其中，五coli NZNlll由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡(NADH/NAD+比例超过2)， 最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株五coli AFPlll由于突变了葡萄糖专性转运系统中的PtsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了 NAD(H) 平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFPlll过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g-L-1·^1.因此，在高产丁二酸大肠杆菌菌株构建过程中，确保胞内辅酶NAD(H)的平衡是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径如图1所示，涉及其合成的基因主要有三个(/7/ M，/7a^，/7a^)，涉及分解代谢的基因主要有两个、naD,yrfE\而NAD+和NADH相互之间的转化反应则多达300多个。相关研究表明，利用DNA重组技术改造NAD(H)生物合成途径是提高NAD (H)总量的有效手段。San等人(Metab Eng, 2002, 4: 238-247 ；Metab Eng, 2002, 4: 182-192)在研究辅因子调控对大肠杆菌代谢流分布的影响过程中，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)使胞内NAD(H)总量提高了 41. 7% ；Heuser等人(Eng Life Sci, 2007, 7: 343-353)通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD合成酶， 或者同时表达这两个酶，使菌株胞内NAD(H)总量提高了 2倍多，并将其应用到酶转化合成 (R)-甲基-3-羟基丁胺过程中，使得NAD (H)的量不再成为限制因素，从而提高了酶转化的效率。众多科学实践也证明利用发酵调控手段可有效调节NAD (H)总量与NADH/NAD+比例， 进而有效提高底物的利用率和产物生产水平。在利用SeiccheiromycGS cerevisiae TMB3001 (Biotechnol Bioeng, 2002, 78 172-178)禾口/7W1Sari腫 oxysporum (J Biosci Bioeng, 2004，97: 299-304. Enzyme Micro Technol, 2005，36: 100-106)发酵木糖生产乙醇的过程中添加乙偶姻作为外源电子受体，有效地增加了胞内NAD+含量，提高了乙醇的产率； San等人(Metab Eng, 2002，4: 182-192)在利用大肠杆菌生产1，2-丙二醇过程中，发现在稀释率为0. 1 IT1恒化厌氧培养系统中，随着碳源还原性的增大，胞内NADH/NAD+比率从 0.51(葡萄糖酸)增加到0. 75(葡萄糖)和0. 94 (山梨醇)，并导致中心代谢流产物乙醇 (消耗2 mol NADH)对乙酸(不消耗NADH)的比率分别为0. 29,1和3. 62。烟酸磷酸核糖转移酶是NAD (H)合成过程中的限速步骤酶且需要ATP的参与(见图1)。在大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在feciBm subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达五COli /7/7C和/74，研究发现过量表达/7/7C可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3. 5倍，而过量表达对发酵结果没有影响，但在 /7/7C缺陷菌株中，的过量表达能够提高琥珀酸的产量。本申请专利技术人团队在先专利申请涉及一株可以利用木糖发酵产丁二酸的基因工程菌株，并进行了菌株专利保藏，专利申请号201110380396. 3，申请日2011年11月25日，生物材料保藏编号CCTCC NO :M2011207。 该菌株可以高效利用木糖发酵产丁二酸，但是不能利用葡萄糖发酵生产丁二酸。若以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因活性，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的菌株大肠杆菌BA204为出发菌株，再过量表达烟酸磷酸核糖转移酶后，得到能够高效利用葡萄糖生长并产丁二酸基因工程菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种能高效利用葡萄糖生长并产丁二酸的基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本， 提高经济效益。为实现本专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案。一、本专利技术提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA205 (.Escherichia coli BA205)，其保藏编号为 CCTCC NO :M 2011447。二、本专利技术所述的大肠埃希氏菌BA205的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶后，得到能够高效利用葡萄糖生长并产丁二酸大肠埃希氏菌 BA205。4进一步地，所述的具体构建步骤如下(1)以缺乏乳酸脱氢酶基因(7 /Μ)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五C^i NzmiI菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，梁丽亚，刘嵘明，苟冬梅，张常青，马江锋，陈可泉，韦萍，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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