一种DNA序列、干扰RNA及其在防治害虫中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种DNA序列，和能使其沉默的干扰RNA，并提供了一种利用此DNA序列和干扰RNA防治害虫的方法。这种防治害虫的方法效率高，易于操作，成本低且环保，对非靶标生物影响小。而且，本方法在害虫整个生命期都能发挥防治效果，不受害虫生命期限制，应用范围更广，具有良好的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA序列和使其基因沉默的干扰RNA，以及在防治害虫中的应用。技术背景农业害虫危害是我国农业产量的重要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；幻农药残留导致环境污染严重; 3)对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广，但杀虫效果缓慢。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除或基因沉默。RNAi的发现是基因的功能研究方法学的重大突破。 2007年“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文表明能够表达靶向害虫的重要致死基因V ATPase A，CYP6AE14 and GSTI的dsRNA转基因植物可以控制病虫害的发生，是害虫防治的新方法(Baum et al,2007 ；Mao et al，2007)。2008 年，Price 禾口 Gatehouse 提出了基于RNAi的害虫防治策略，该策略有如下优势1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的 抗虫具有专一性，对非靶标生物不具有杀伤性；幻对环境无毒无害。广泛用于昆虫RNAi实验的基本方法有两种。一种方法是采用体外合成的dsRNA， 然后将其导入昆虫体内或细胞中，称为外源性RNAi ；另一种方法是用DNA表达载体导入昆虫体内或细胞中，在体内或细胞中表达时合成dsRNA，称为内源性RNAi。尽管内源性方法可以在昆虫生活史的任何时间实现细胞特异性或组织特异性的RNAi，具有遗传性等优点，但由于很多昆虫还没有建立成功的转基因体系，所以这种方法目前还并不适合许多昆虫的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重点手段。而实现基于RNA干扰进行害虫有效控制的关键则是筛选对昆虫高效致死的干扰RNA。目前利用RNA干扰技术杀灭害虫的研究虽然有一定的进展，但能够实现对害虫进行有效杀灭的靶点仍然十分稀少且效果仍难以令人满意，例如昆虫蜕皮基因是目前研究较多的一个靶点，利用对该基因的干扰可以实现杀灭昆虫，但是对该基因的干扰必须是在昆虫蜕皮前四天进行，因此对时间的要求较高，从而使得实验实施起来较为复杂(Zhang，Yin et <37,2007)。fl ^ Bl J^ # yg ^ ^(prophenoloxidase activated system, proPGAS) 在参与无脊椎动物的黑化防御反应中起着重要作用。β-1，3-葡聚糖识别蛋白 (β -1，3-glucan-recognition protein, β GRP)是一种重要的真菌模式识别受体，它主要参与识别真菌细胞壁成分β -1，3-葡聚糖，进而激活酚氧化酶(phenoloxidase，P0)的酶原形式，即酚氧化酶原(prophenoloxidase，ΡΡ0)存在，无活性的PPO在丝氨酸型蛋白酶作用下被激活转变成具有活性的P0，进而将体内多巴胺催化生成黑色素并最终实现生物体的黑化防御反应。黑化防御反应伴随着动物的一生。β-1，3-葡聚糖识别蛋白参与识别真菌细胞壁成分，在活化酚氧化酶原激活系统中具有关键作用，因此采用RNAi技术，开展 β -1，3-葡聚糖识别蛋白dsRNA在害虫防治中的作用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA序列，可编码β -1，3-葡聚糖识别蛋白。本专利技术的另一目的在于提供用于沉默上述DNA序列的干扰RNA。本专利技术的另一目的在于提供一种防治害虫的方法。本专利技术的目的是通过如下措施实现的。一种DNA序列，它具有序列表中SEQ ID NO: 1所述的碱基序列或对SEQ ID NO: 1 所示碱基序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID N0:1相同功能的碱基序列。一种DNA序列，它具有能在高度严格条件下与SEQ ID NO: 1所示碱基序列或对SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列进行一个或多个核酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO: 1相同功能的碱基序列杂交的碱基序列。上述DNA序列，来源于昆虫纲。优选地，上述DNA序列，来源于蝗虫。更优选地，上述DNA序列，来源于东亚飞蝗。专利技术人利用SignalP3. 0等软件和基因进化树等方法对上述cDNA序列编码的氨基酸序列进行了分析后得出，上述DNA序列编码β-1，3-葡聚糖识别蛋白。见图2、3。一种氨基酸序列，由上述DNA序列编码。一种氨基酸序列，具有SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列或对SEQ ID N0:2所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID N0:2相同功能的氨基酸序列。上述DNA序列包含一些重要的基因片段，它们在DNA序列中以及其编码的氨基酸序列是相对保守的，一般情况下是不可取代或缺失的。图4所示即上述DNA序列中重要的基因片段和对应的氨基酸序列。图5中黑色标记的片段是最为保守的，灰色标记的片段氨基酸的性质是保守的，在不改变氨基酸性质的前提下序列是相对可变的。专利技术人利用RNA干扰技术以上述DNA作为靶标使之沉默，以用于后续研究。一种使上述DNA序列沉默的干扰RNA。优选地，上述干扰RNA由SEQ ID N0:6和 SEQ ID N0:7引物对逆转录得到。专利技术人对将上述的DNA序列和干扰RNA序列用于防治害虫的研究。一种防治害虫的方法，其特征在于利用上述干扰RNA使上述DNA序列沉默。本专利技术具有如下有益效果本专利技术所述DNA序列参与调控动物的黑化防御反应，当所述DNA的表达受到抑制时，防御反应同时被抑制。使用本专利技术所述的防治害虫的方法效率高；易于操作，成本低；保护环境，对非靶标生物影响小；且在害虫整个生命期都能发挥防治效果，不受害虫生命期限制。附图说明图1 东亚飞蝗AC基因全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列；cDNA序列中多聚腺苷酸尾AATAAA用双实线标出，终止密码子TAG用▲标出图2采用SignalP3. 0对东亚飞蝗Ζ A 6 °序列分析的结果图3 DAN序列编码的氨基酸序列与含有β-1，3-葡聚糖酶同源结构域的蛋白家族成员的进化树分析图4 DAN序列中重要的基因片段和对应的氨基酸序列图5 DAN序列编码的氨基酸序列推导的β-l，3-glucanase-like区域与其他昆虫 β GRP的同源性比较图6东亚飞蝗β GRP基因全长cDNA序列PCR结果电泳7 东亚飞蝗β GRP基因全长cDNA序列测序峰8 β GRP被双链RNA干扰后生测结果分析及干扰效率分析图9干扰后东亚飞蝗异常黑色稀便a 注射了 ds-gfp的野生型东亚飞蝗排泄的为灰色硬便；b β GRP干扰后的东亚飞蝗排泄的为异常黑色稀便具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术做出一些非本质的改进和调整。本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏玉先，郑小莉，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：