本发明专利技术提供一种抗vWF(von?Willebrand?factor)单克隆抗体，这种抗体能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合。将这种单克隆抗体固定在层析基质上制成亲和介质，可用于纯化vWF，也可用来纯化凝血因子VIII。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体的说，本专利技术涉及一种高亲和力的抗vWF(v0n Willebrand factor)单克隆抗体，这种抗体能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子 VIII的复合体结合。同时还涉及一种利用该抗体纯化vWF的方法和一种利用该抗体纯化凝血因子VIII的方法。
技术介绍
凝血过程是一个复杂的过程，它包括一系列的生化反应，涉及十多种凝血因子。任何凝血因子的缺失或功能变异都会导致凝血相关疾病。血友病就是一种缺乏凝血因子VIII 或vWF(von Willebrand factor)而导致的出血性疾病。vWF存在于血浆中，它是凝血因子VIII的载体，能够稳定凝血因子VIII，并防止凝血因子VIII被蛋白酶水解。同时VWF是一种黏附性糖蛋白，在血小板的黏附中起着核心作用。通过血小板在受损血管壁的粘附，启动凝血过程。vWF是由230kD亚基组成的多聚体， 其分子量从5 X IO5到107Da。vWF含有5_6%的糖，这些糖对于vWF结合血小板的功能非常重要。vWF是在内皮细胞(endothelial cell)和巨核细胞(megakaryochtes)中合成。并通过二硫键形成二聚体。再以聚体为基础连接形成高聚体。高分子量的vWF多聚体在凝血过程中非常重要。各种vWF活性异常会导致von WiIlebrand综合症。过多的vWF会增加血栓的风险，而vWF水平过低会导致出血的倾向，由于抑制了血小板的聚集，受伤后的出血时间延长。vWF的缺乏还会表现出甲型血友病的症状，这是由于vWF对于凝血因子VIII的稳定性非常重要，vWF的缺乏导致凝血因子VIII的半衰期缩短，从而使血液中凝血因子VIII 的活性降低而表现出甲型血友病的症状。治疗von Willebrand综合症的常规方法是用血浆中提取的vWF，也可以用纯化的vWF或vWF-FVIII复合物。EP-A-0503991和W0-A-8912065 提供了用离子交换纯化vWF的技术。US 6605222和US 6579723提供了制备vWF-FVIII复合物的技术。凝血因子VIII是凝血级联反应中的重要因子。它是一个分子量^OkD的糖蛋白， 包含200kD和80kD两条肽链。凝血因子VIII被凝血酶活化后可以加速因子X的活化，最终形成血块。甲型血友病就是凝血因子VIII的缺失的一种性染色体连锁疾病，占男性人口的万分之一。血友病的症状是受伤后血液不能形成血凝块或血凝块形成很慢，导致出血不止或出血时间过长。血友病的主要治疗手段就是补充凝血因子VIII。在早期，采用输入全血或血浆的办法来为血友病病人止血。但这种方法输血体积大，输入的凝血因子VIII量也少，只能治疗轻度血友病病人。对于严重的血友病病人不能有效治疗。1974年美国专利 US3803115专利技术一种冷沉淀法制备凝血因子VIII的浓缩物，随后US Re 29698对此方法进一步改进，得到了活性更高的浓缩物。利用凝血因子VIII的浓缩物治疗血友病，可以输入更多的凝血因子VIII，大大改善了血友病的治疗效果。虽然冷沉淀浓缩物中凝血因子VIII 的比活性与比血浆相比大幅度提高，但仍含有大量杂蛋白，输注后导致的免疫反应等副作用仍然很大，输注量也很大。冷沉淀浓缩物中凝血因子VIII的稳定性和冷沉淀浓缩物冻干后的溶解性也不够理想。于是人们在冷沉淀浓缩物基础上通过各种技术手段进一步纯化凝血因子VIII。US Re. 32011提供一种纯化凝血因子VIII的方法，其过程包括先用抗VWF 单克隆抗体亲和吸附凝血因子VIII与vWF的复合体，再洗脱凝血因子VIII，然后用氨己基琼脂糖纯化。其制备的凝血因子VIII比活性与血浆相比提高160000倍，活性达到2300u/ mg。虽然目前从血浆提取的凝血因子VIII的纯度已经非常高，但是存在着感染传染病的风险。随着基因技术的提高，现在已成功克隆出凝血因子VIII的基因并成功在细胞中表达。 重组凝血因子VIII与血浆提取的凝血因子VIII相比具有很大优势首先是减小了血液传染病的风险，其次是不受血浆来源的限制，可以大量生产满足市场需要。再次，重组凝血因子VIII产品的纯度极高，相比血源凝血因子VIII副作用更小。重组的凝血因子VIII在国外有取代血浆提取凝血因子VIII的趋势。目前市售的重组的凝血因子VIII有全长凝血因子VIII和B区删除的凝血因子VIII两种。B区删除后凝血因子VIII稳定性大幅度提高， 有利于生产工艺中的控制。但使用效果两者没有明显区别。无论是全长凝血因子VIII还是B区删除的凝血因子VIII，其纯化过程都包括一系列复杂的层析纯化，但所有已商品化的重组凝血因子VIII的生产过程都包含了抗凝血因子VIII单克隆抗体的免疫亲和层析。 免疫亲和层析的优点是浓缩倍数高，产品纯度好。最近美国专利US 5597711和US 5994310 又开发出来用肽来代替抗体的亲和层析技术。目前抗vWF抗体广泛地用于vWF的检测。美国专利US 5916805，和US6^0731提供了一组抗vWF单克隆抗体，能够阻止血小板的聚集，具有潜在的治疗血栓的用途。美国专利US 6228360提供的抗vWF抗体的亲和力Kd在100 0. InM之间。本专利技术提供了一种抗 vWF单克隆抗体，既能与vWF结合也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合，既能用于纯化 vWF也能用于纯化凝血因子VIII。本专利技术提供的抗vWF抗体与vWF的亲和力Kd为0. 06nM。 亲和力高于已知同类抗体。用于亲和纯化时，高亲和力的抗体能得到高的产品纯度。
技术实现思路
本专利技术提供一种高亲和力的抗vWF鼠单克隆抗体，它能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合。该抗体的特征在于其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :1，重链氨基酸序列为SEQ ID NO :2 ；其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:3，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ；轻链上互补决定区⑶R1，⑶R2，⑶R3的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO 5, SEQID NO :6，SEQ ID NO 7 ；重链上互补决定区 CDRl，CDR2, CDR3 的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。该抗体与vWF的亲和力Kd 为0. 06nM。该抗体制备过程如下采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以重组人vWF蛋白为免疫原，免疫剂量为50 μ g/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次，4天后取免疫小鼠脾细胞，按4 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用重组人vWF蛋白作为包被抗原， 用ELISA法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，得到稳定分泌vWF特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择分泌所需抗体的细胞株，收集培养的细胞，按照说明书 (Invitrogen)加入TRIzol，提取总RNA，电泳检测RNA质量，UV测定浓度。按Roche反转录试剂盒操作说明反转为cDN本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢良志，盖文琳，张建东，孙春昀，罗春霞，
申请(专利权)人：神州细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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