一种重组人巨细胞病毒蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人巨细胞病毒蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明专利技术提供的编码人巨细胞病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人巨细胞病毒蛋白感染临床诊断的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种人巨细胞病毒蛋白及其应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，简称HCMV)属疱疹病毒β亚科，是一种DNA病毒，其感染在人群中广泛存在，我国人群中HCMV感染相当严重。妇女在妊娠初期受HCMV原发感染是引起胎儿宫内感染和发育缺损的重要原因，在孕期原发性感染HCMV的胎儿和新生儿中，80%可导致智力低下、畸形和死亡。HCMV也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染死亡的主要原因之一。对非免疫缺陷者常导致长期隐性感染，甚至引起感染细胞的转化、畸变或癌变等 。因此快速准确的诊断HCMV病毒感染具有十分重要的意义。目前巨细胞病毒感染诊断方法有脱落细胞及组织病理检查、病毒分离、分子杂交试验和血清学检查，但由于前三种方法技术设备要求高，检测周期长的局限性，无法广泛使用，而血清学检查具有简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用，目前大多检测试剂采用盒用的HCMV蛋白质抗原主要是来源于病毒培养物或是重组表达的单一蛋白片段，或者由于蛋白质抗原纯度低及特异性差，造成假阳性而降低检测特异性；或者由于单一片段抗原蛋白所含抗原决定簇较少，所识别的抗体相应较少，易造成假阴性而降低检测敏感性，虽然多种单一片段组合制备检测试剂也可以避免上述问题，但必然要求多次进行提取纯化过程，而且小分子蛋白质或多肽的提纯技术要求更高，工作效率太低。另外，在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段，HCMV疫苗的研制也是进行HCMV研究的重要领域之一，而疫苗研究的一个重要前提是其所用蛋白质抗原应具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此开发一种多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术是十分必要的。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种重组人巨细胞病毒蛋白，本专利技术的另一目的是提供该重组人巨细胞病毒蛋白在制备检测试剂盒中的应用。(二)本专利技术的技术方案本专利技术提供了一种编码人巨细胞病毒蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的人巨细胞病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ3ID NO 2 所示。本专利技术还提供了一种人巨细胞病毒蛋白的表达载体pETj8a-HCMV，它是将SEQ ID NO 1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图 2所示。将表达载体pET18a-HCMV导入大肠杆菌中，得到表达人巨细胞病毒蛋白的工程菌株。本专利技术利用SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人巨细胞病毒蛋白可以通过如下步骤实现1)获得具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET_28a质粒；3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)菌株中；4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。本专利技术提供的检测人巨细胞病毒感染的试剂盒，其组分中的抗原是本专利技术所述的重组人单纯疱疹病毒蛋白。用于标记人巨细胞病毒蛋白的标记物选白自制胶体金、辣根过氧化物酶(HRP)。本专利技术所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgG抗体划线包被浓度为 2. Omg/ml,HCMV抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。抗人IgG抗体划线量为1. 0μ 1/cm，胶体金结合物喷点量为25. 0μ 1/cm。兔抗巨细胞病毒抗体包被量为 1. 0 μ 1/cm,包被浓度为 5. Omg/ml。以下将更详细的描述本专利技术的技术方案本专利技术公开了一种编码人巨细胞病毒蛋白的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 利用该核苷酸序列制备人巨细胞病毒蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的人巨细胞病毒蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人巨细胞病毒感染的应用。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，优选根据目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于扩增ppl50第1447位到第2046位核苷酸， P3和p4用于扩增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4分别带有NdeI和XhoI 的酶切位点，引物P2和p3顺序互补，并共同对应于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT以人巨细胞病毒培养物为模板，以引物Pl和P2扩增ppl50片段，以引物P3和P4 扩增pp65片段；再以第一轮PCR扩增得到的ppl50片段和pp65片段为模板，加入引物Pl 和P4，扩增pp 150pp65片段；得到串联的目的基因重组片段pp 150pp65。本专利技术对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。本专利技术的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列制备人巨细胞病毒蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码人巨细胞病毒蛋白的如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本专利技术的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。编码本专利技术蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本专利技术的蛋白的表达。在本专利技术的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子和pETj8a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。本专利技术的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的人巨细胞病毒蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。本专利技术的一个实施方案涉及包含本专利技术人巨细胞病毒蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人单纯疱疹病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的巨细胞病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有人巨细胞病毒抗体， 就可用本专利技术蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。本文所述“试剂盒”是指利用本专利技术蛋白完成人巨细胞病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断人巨细胞病毒感染。本专利技术试剂盒可包括其它多个容器， 其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。在用于人巨细胞病毒感染检测的试剂盒中，本专利技术的人巨细胞病毒蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷友，王志新，王健，张晓刚，
申请(专利权)人：英诺特唐山生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：