本发明专利技术公开了一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用原核表达的方法表达水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的外壳蛋白CP为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗RBSDV单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株5G1，其保藏号为CGMCCNo.5537。5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株细胞分泌的单抗与RBSDV的外壳蛋白有特异免疫结合反应。利用5G1单抗为核心建立的检测稻飞虱和水稻中RBSDV的dot-ELISA检测方法，当单头灰飞虱稀释到1600?L时，病叶1:160倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。抗RBSDV单抗的制备及其检测方法的建立为该水稻病毒病的诊断、预报及科学防控提供技术和物质支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
水稻黑条矮缩病曾于1960年代中期在浙江及华东诸省市不少地区的稻、麦和玉米等禾谷类粮食作物上严重为害，其中浙江发病较重致使当时以东阳为中心的浙中玉米种植区被迫改变栽培制度，此后20年发病面积迅速下降直至70年代销声匿迹。近年来由于受耕作栽培制度改变、气候变暖、灰飞虱暴发等多种因素影响导致黑条矮缩病在浙江、上海、江苏、安徽、江西等地发生、流行。水稻黑条矮缩病由水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)引起，该病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。该病毒可侵染水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、马唐、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻的黑条矮缩病和玉米的矮缩病。病毒粒体球状，直径70 75 nm。病毒基因组为双链 RNA(dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为SI S10，其中SlO编码病毒的外壳蛋白。 细胞质中病毒粒子以三种形式存在一种是分散或不规则聚集，另一种是有规则的晶状排列，再一种病毒粒子排列成串，外包一层膜，呈豆荚状、鞘状或管状构造。水稻黑条矮缩病毒是一种由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)为主要传播媒介的病毒，极具暴发性、间歇性和迁移性。水稻一旦感染上该病毒就无法防治。其中秧苗2叶 4叶心叶期为最易感病期，且极显著高于其他生育期。因此秧苗期是防治灰飞虱传毒的关键时期。感病水稻的症状表现为分蘖增加，叶片短阔、僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上初现蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起，不抽穗或穗小，结实不良。不同生育期染病后的症状略有差异，具体表现为苗期发病心叶生长缓慢，叶片短宽、僵直、浓绿，叶脉有不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色，根短小，植株矮小，不抽穗，大田移栽后枯死；分蘖期发病新生分蘖先显症，主茎和早期分蘖尚能抽出短小病穗，但病穗缩藏于叶鞘内；拔节期发病剑叶短阔，穗颈短缩，结实率低，叶背和茎秆上有短条状瘤突。水稻黑条矮缩病毒传毒介体灰飞虱一经获毒，终身带毒，但不经卵传毒。病毒主要在大麦、小麦病株上越冬，有部分也在灰飞虱体内越冬。田间病毒通过麦-早稻-晚稻的途径完成侵染循环。第一代灰飞虱在病麦上接毒后传到早稻、单季稻、晚稻和青玉米上传毒。 稻田中繁殖的2、3代灰飞虱，在水稻病株上吸毒后，迁入晚稻和秋玉米传毒，晚稻上繁殖的灰飞虱成虫和越冬代若虫又进行传毒，传给大麦、小麦。灰飞虱最短获毒时间30分钟，1-2 天即可充分获毒，病毒在灰飞虱体内循回期为8-35天，接毒时间仅1分钟。灰飞虱带毒情况及发生数量成为水稻黑条矮缩病发病流行的重要因素。为了掌握灰飞虱自然种群带毒及水稻发病状况，强化我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测灰飞虱体内及水稻中RBSDV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法等方法进行小样本检测。本专利技术以RBSDV外壳蛋白(CP)为CN 102533664 A抗原通过杂交瘤技术制备了 1株抗RBSDV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测RBSDV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间RBSDV的检测，从而为我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No. 5537， 它能分泌抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_6以上，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与水稻黑条矮缩病毒56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果1)提供的杂交瘤细胞株分泌抗水稻黑条矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和 TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测水稻黑条矮缩病毒；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测水稻黑条矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物及灰飞虱中的水稻黑条矮缩病毒的检测。附图说明图1是dot-ELISA方法检测水稻RBSDV的灵敏度分析； 图2是dot-ELISA方法检测水稻田间样品中RBSDV的结果； 图3是dot-ELISA方法检测灰飞虱体内RBSDV的灵敏度分析； 图4是dot-ELISA方法检测田间灰飞虱体内RBSDV的结果。具体实施例方式分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞，于2011年11月观日，保藏于中国科学院微生物研究所，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5537，它能分泌抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_6以上，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与水稻黑条矮缩病毒56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测RBSDV的高通量的血清学方法，并可应用于田间RBSDV的检测，从而为我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备 1.免疫原及检测抗原的制备根据GenBank中报道的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的衣壳蛋白基因(CP基因)序列设计引物CP-F :5-CGGGATCCATGGCTGACATAAGACTCGA~3 和 CP - R :5~CG GTCGACTCATCTTGTCACTTTGTTTAG-3,上游引物对应于日本分离物(Accession No. D00606) 的22-41 nt，下划线处为BamH I酶切位点，下游引物与中国浙江分离物(Accession No. AJ297433)的1678-1698 nt互补，下划线处为Sal I酶切位点，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。利用Trizol试剂提取水稻病样的总RNA，第一链cDNA的合成按照 RevertAidTM逆转录试剂盒说明书进行，即模板RNA 2 μ ，下游引物1 μ ，RNase Free H2O 9 μ 。混勻后 70°C下 5 min，取出置冰上 3-5 min ；加入 4 μ 5 X RT Buffer, 2 μ dNTP Mix, 1 M-I Rnasin Inhibitor,混勻后 37°C下 5 m本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，倪跃群，刘欢，饶黎霞，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。