稻瘟病菌无毒基因分子检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及稻瘟病菌无毒基因分子检测的引物及其用法，用于稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子检测，属于农作物病害防治和抗病育种领域。设计了两对引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，可以分别检测稻瘟病菌的无毒基因Avrpik和Avrpizt，特异性扩增的DNA片段长度分别为184bp和153bp。适用于稻瘟病菌纯培养物和发病部位稻瘟病菌群体无毒基因组成的分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及稻瘟病菌无毒基因分子检测的引物及其用法，专用于稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子检测，属于农作物病害防治和抗病育种领域。
技术介绍
稻癌病是由 Magnaporthe oryzae (无性态Pyricularia oryzae)弓丨起的一种突发性强、易于流行的水稻病害，是世界各水稻产区广泛分布的重要病害之一。利用寄主抗性，培育和种植抗病品种可以有效地控制植物病害的发生。迄今，通过广泛的遗传分析，已定位了 85个稻瘟病抗性基因和347个数量性状位点(Quantitative trait loci, QTL), 绝大部分的基因和QTL被定位在水稻的不同染色体上，其中Pi21、Pi21、Pi22、Pi23、Pi34、 Pi35 (t)、Pbl、Pif、Pikurl、Pikur2、Pi-sel 11个属于单基因控制的部分抗性基因，其余的 74个均为主效抗性基因。在85个基因中，70个基因采用分子标记进行了染色体定位，5个基因通过与已知基因的等位性测定确定了其染色体位置。目前已从水稻中克隆了 13个稻癌病抗性基因，即 Pib、Pita、Pi2、Pi9、Pi-zt、Pi-d2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3、Pikh 以及2个QTL位点，即P21和Pbl。水稻对稻瘟病的抗性属于典型的小种专化性抗性，水稻的抗病基因与病菌的无毒基因之间存在特异性识别。病菌无毒基因与寄主植物抗病基因之间可以发生符合“基因对基因假说”的相互作用，即寄主植物中每个显性的抗病基因，在病原菌中对应一个显性的无毒基因。寄主的抗病基因产物通过直接或间接的方式对病原菌的无毒基因产物进行识别， 启动防卫反应，进而产生对病原菌的抗性，只有寄主植物中存在相应的抗病基因，而病菌中又存在相应的无毒基因，植株才会表现出抗病性。目前虽然已鉴定出较多的抗稻瘟病基因，但是考虑到基因的抗谱，在特定水稻种植地区能够应用的抗病基因数目仍然有限。由于QTL表达受环境等因素影响较大，长期以来抗病育种中应用的大都是主效抗病基因，因此，导致生产中存在的突出问题是携带单一稻瘟病抗病基因的水稻品种大面积推广种植3-5年后即变为感病品种，这也是长期困扰育种家和植物病理学家的难题。稻瘟病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，无毒基因是病原菌中决定寄主植物品种特异抗性表达与否的基因，其缺失、表达破坏或功能区域的变异将导致病原菌群体中产生新的毒性小种，继而导致含有对应抗病基因的作物品种丧失抗病性。了解和监测田间稻瘟病菌的无毒基因组成可以为通过品种合理布局和轮换防治稻瘟病以及选用抗病基因进行抗病育种工作提供重要的信息。鉴定稻瘟病原菌无毒基因的传统方法是利用携带单一稻瘟病抗病基因的近等基因系或单基因系，通过在水稻苗期进行人工接种，观察植株的抗感反应型来分析病菌所携带的无毒基因。采用人工接种技术鉴定病菌的无毒基因，首先需要从植株的发病部位分离获得病菌的单孢子培养物，然后种植鉴别品种，在4-5叶期喷雾接种。该方法的主要缺陷是需要分离病菌，人工接种耗时较长，从育苗至完成植株表型调查至少需要30天；另外，人工接种后水稻植株需要低温和保湿处理，如果同时对多个菌株进行接种分析，需要相互隔离， 因而需要较大的能控制环境条件的空间。稻瘟病菌无毒基因的克隆和分子检测技术的发展为检测病菌无毒基因提供了可能。目前国内外研究者已定位了 40多个稻瘟病菌无毒基因，其中9个已被克隆。PWLl 和 Pm^ 首先被克隆出来，2000 年以后，AvrPi-ta、Avrl_C039、ACEU AvrPiz-t、AvrPia、 AvrPii、AvrPik/km/kp等7个无毒基因又先后被克隆。设计稻瘟病菌无毒基因特异性引物， 通过PCR或荧光定量PCR技术，将有效地分析稻瘟病菌无毒基因，可以为快速鉴定田间稻瘟病菌的无毒基因组成和分布提供一种新技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供瘟病菌无毒基因分子检测的引物，用于稻瘟病菌无毒基因 Avrpik和Avrpizt的快速分子检测。本专利技术的目的通过以下技术方案实现稻瘟病菌无毒基因快速分子检测引物，包括稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt 特异性扩增引物两对，即Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，其序列分别为Avrpik-F 5，_actttgggaactgtcgctgtc_3，；Avrpik-R 5， _agctgtaacaggttccagcatc_3，；Avrpizt-F 5， -aaaccagggcagccaaaga-3，；Avrpizt-R 5， _attcccaatcgagccaacg_3，。其中Avrpik-F/R在携带无毒基因Avrpik的稻瘟病菌株上扩增出184bp的产物； Avrpik-F/R在携带无毒基因Avrpizt的稻瘟病菌株上扩增出153bp的产物(图1)。上述稻瘟病菌无毒基因分子检测引物的用法包括(1)稻瘟病菌单孢菌株无毒基因的检测将稻瘟病菌菌株转接在番茄燕麦培养上，于^TC条件下培养5-7天，刮取培养基表面的菌丝和孢子约5mg用于DNA提取。液氮研磨菌体，加入600 μ 1 CTAB抽提液，65°C处理30min，每隔IOmin震荡一次，加入等体积的苯酚，置于摇床上轻摇lOmin，10000rpm,4°C 离心lOmin，取上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇25 24 1，轻摇lOmin，lOOOOrpm， 4°C离心lOmin，小心抽取上清，加入等体积氯仿异戊醇(24 1)，轻摇lOmin, lOOOOrpm, 4°C离心lOmin。重复上两个步骤，直至有机相和水相之间无蛋白层出现，取上清，加入2/3 体积预冷的异丙醇，产生絮状沉淀，用玻璃棒将DNA搅出，置于1. 5mL干净离心管，75%乙醇清洗2次，吹干后溶于TE，保存于-20°C备用。采用两对特异性弓I物Avrp ik_F/R和Avrp i zt-F/R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为 25 μ 1，含 IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP 2. O μ 1，10 μ mol/L 1. O μ 1 正向和反向引物，5U/ μ 1 Taq 酶 0· 2 μ 1，，20ng/ μ 1 模板 DNA2 μ l,ddH20 16. 3 μ 1。PCR 反应程序为94°C 5min, 94°〇458，56或591458，721 1. 5min，；35 个循环，终延伸 72°C IOmin0 扩增产物在 1.8%琼脂糖凝胶中电泳，经染色后观察扩增产物的大小判定结果。(2)稻瘟病病样上稻瘟病菌无毒基因的检测田间采集稻瘟病病样，用于提取DNA。称取5mg植株病斑处标样，采用(1)的方法提取DNA，或者采用 Epicentre 公司的MasterPure DNA Purification Kit提取、纯化DNA。DNA样品溶解于10 20 μ 1 TE中，经琼脂糖凝胶电泳检测后保存于_20°C备用。 采用两对特异性弓I物Avrp ik_F/R和Avrp i zt-F/R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为 25 μ 1，含 IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP 2. 0 μ 1，10 μ mol/L 1. 0 μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周永力，李祥晓，徐建龙，王疏，黎志康，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：