本发明专利技术涉及涉及甘薯上的马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒及其检测方法。试剂盒分为上、下两层，上层放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、NBT、BCIP和Tris-HCl溶液。检测样品时，当需要确定样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒时，使用混合抗体试剂瓶检测；当需要确定某种特定病毒时，使用其他特异性抗体检测，检测方便，节省成本，检测方法简单、直观，方便实用。本发明专利技术可应用于脱毒甘薯茎尖苗和各级种薯的检测，通过对Potyviruses病毒的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，特别是涉及甘薯上的马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
甘薯羽状斑驳病毒potato feathery mottle 口>狀，SPFMV)、甘薯潜隐病 : {Sweet potato latent virus, SPLV)^1^ G ^ {Sweet potato virus SPVG)禾口甘薯脉花叶病毒(Sfveet potato vein mosaic virus, SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4种病毒都属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)A种病毒或与其他病毒常常混合侵染甘薯，造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用茎尖分生组织培养，培育脱毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。 在脱毒甘薯的培养和脱毒种薯(苗)实现产业化过程中，病毒的快速检测技术是保证脱毒种薯质量以及实现脱毒种薯产业化非常关键的技术。只有利用快速、高效的病毒检测技术， 筛选出真正无毒的试管苗并及时淘汰不同级别的感病种苗，才能使真正的脱毒种薯用于生产，确保脱毒种薯的增产效果，进而加快脱毒种薯的推广进程。因此，建立甘薯病毒高效的检测技术是培育脱毒甘薯的前提和基础。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术，以及在此基础上建立的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)技术。由于侵染甘薯的PoiJ^ir皿^病毒种类较多，当不需要确定病毒种类，只需要确定样品中是否含有病毒时(譬如对甘薯脱毒茎尖苗进行检测)，利用上述方法进行检测时需要对各种病毒逐一进行检测，往往费时费力，造成浪费。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题克服
技术介绍
中的问题，提供一种简便、高效和低成本的检测甘薯上四种马铃薯Y病毒属病毒的试剂盒；另外还提供了这种试剂盒的检测方法。本专利技术的技术方案甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，所述试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和1Tris-HCl溶液。所述试剂瓶为九个，其中一号试剂瓶装有甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶装有甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶装有甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶装有甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶装有上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶装有工作浓度为1 :1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG，七号试剂瓶装有浓度为50mg/ml 的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶装有浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶9装有pH为7. 5的2M Tris-HCl溶液。所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体均是利用大肠杆菌中表达的病毒外壳蛋白，通过纯化蛋白、免疫家兔的方法制备获得，所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和混合抗体的效价均为4096倍，工作浓度为1 :1000倍。甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤(1)准备硝酸纤维素NC膜剪取合适大小的NC膜，用铅笔在膜上做好标记，以便于点样；(2)样品处理将0.Ig甘薯样品于液氮中速冻，并研磨成粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提缓冲液， 继续研磨至彻底裂解并转移到离心管中，5000rpm离心5min ；(3)点样将NC膜置于TBS中浸泡1min，用滤纸吸去膜表面的液体，取上清液5μ1点于膜上，室温晾干；(4)封闭加入IOml封闭液于培养皿中，将膜浸入其中，室温孵育60min ；(5)洗膜弃去封闭液，用TBS洗膜一次；(6)加一抗将NC膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗体中，室温下以50rpm/min 的速度振荡，孵育过夜；(7)洗膜弃一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(8)加二抗用滤纸吸去NC膜上多余的溶液，然后将NC膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下以50rpm/min的速度振荡，孵育1 h ；(9)洗膜弃二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(10)显色将NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物缓冲液先加入33μ1 ΝΒΤ，再加入16. 5μ1 BCIP，室温下以50 rpm/min的速度摇床振荡，避光显色5_30 min ；(11)终止反应将NC膜从底物溶液中取出，用蒸馏水洗NC膜3次，3-4min/次；(12)阳性判断将NC膜晾干后观察颜色反应，比较检测样品与正负对照的颜色反应， 出现紫色的样品为阳性。所述抽提缓冲液为TBS和0. 2%亚硫酸钠的混合液。所述封闭液的成分为TBSJ%脱脂奶粉和洲聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。 所述工作浓度的抗体为SPFMV、SPLV, SPVG, SPVMV抗体或混合抗体，抗体工作浓度均为1 :1000倍；所述酶标抗体为碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG抗体，酶标抗体的工作浓度为1 :1000倍。本专利技术的有益效果(1)本专利技术提供了一种检测甘薯上病毒的简便、高效和低成本的试剂盒。 检测样品时，当只需要确定样品中是否含有PoiJ^ir皿M病毒时使用试剂盒中装有混合抗体的试剂瓶进行检测；当需要确定含有某种特定病毒时，再使用其他试剂瓶中的特异性抗体，检测方便，节省了检测成本。(2)本专利技术的检测方法简单、直观，只需要将NC膜晾干后观察颜色反应，比较检测样品与正负对照的颜色反应，出现紫色颜色反应的样品为阳性，从而判断出是否含有Potyviruses病毒，方便实用。(3)本试剂盒可应用于脱毒甘薯茎尖苗和各级种薯的检测，通过对/^ij^irMM 病毒的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果；也可对甘薯病毒的种类进行特异性检测，可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中。(4)本试剂盒特别适用于甘薯脱毒茎尖苗的检测，也可直接推广到基层农技单位开展病害普查和预测预报，或用于脱毒甘薯种薯的质量监测，使真正的脱毒甘薯应用于生产。附图说明图1 本专利技术的试剂盒结构示意图；图2 本专利技术的试剂盒对甘薯样品检测结果显示图。具体实施方式实施例1、甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，参见图1，图中1为试剂盒上层，2为试剂瓶，3为试剂盒下层。试剂盒中含有四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和一种混合抗体，所述的试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；上层的试剂瓶为九个，分别为一号至九号试剂瓶，其中一号试剂瓶中的甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶为甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶为甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶为甘薯脉花叶病毒 SPVMV抗体，五号试剂瓶为上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶为工作浓度为1 :1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG 二抗，七号试剂瓶为浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶为浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张振臣，乔奇，张德胜，秦艳红，田雨婷，王永江，王爽，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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