高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法技术

本发明专利技术公开一种高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，第一阶段：在发酵培养基中加入≤0.5g/L的含苯有机物和5～20g/L的糖作为碳源，接入两种或两种以上的微生物种子液，利用在线信号判断碳源消耗量，流加碳源保证微生物生长所需；第二阶段：当微生物细胞吸光密度30，用不含氮碱性溶液调pH值并停止补氨水和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量降低至0.001mol/L实现氮限制；监控溶解氧和pH值的变化，当二者同时迅速上升加碳源转化为含苯聚羟基烷酸酯。本发明专利技术利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给合成既含短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种。
技术介绍
伴随石油化工的发展，合成塑料已成为人们生活和生产密不可分的工业产品。但是大量不可降解塑料的废弃已造成愈来愈严重的“白色污染”，日益威胁着人类赖以生存的环境，因此开发可生物降解的塑料已成为当务之急。目前采用生物技术生产的生物可完全降解的塑料中，研究得比较多的有两类聚乳酸和聚羟基烷酸酯。尤其后者的物化性能与聚丙烯相近，还具有生物相容性、光学活性、压电效应、低透氧性、抗紫外线和抗凝血性等许多独特的优点，在医用产品领域也有广泛的用途。临床医学研究表明含苯基功能团的有机物苯乙酸和苯丁酸等具有抗肿瘤、镇痛和化学预防治疗等功能。如果将苯基功能团引入生物高分子聚合材料一一聚羟基烷酸酯中，合成出具有优良物理化学和机械性能的含苯聚羟基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解过程中缓慢释放出含苯基功能团的有机酸如苯乙酸、苯丁酸等的特点，从而使生物可降解医用材料聚羟基烷酸酯在使用过程中具有抗肿瘤、镇痛等新的医学作用，可为扩大该类生物高分子材料在医学方面的应用奠定良好的基础。不含苯基功能团的聚羟基烷酸酯的生物合成技术已经基本成熟，如利用发酵法合成聚羟基丁酸酯(PHB)的浓度可达到每升140克，合成的羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的浓度能达到每升50 90克左右，这使它们的生产成本大幅度降低，具备了工业化规模生产的条件。但是利用微生物以含苯有机物(如苯戊酸、苯乳酸等)为碳源合成含有苯基功能团的聚羟基烷酸酯时，由于通常微生物代谢含苯有机物的速率较低，而且有机物碳源对细胞生长有明显抑制作用等原因，使得最终得到的细胞浓度和产物浓度都较低。近期报道的两段流加式高密度发酵合成聚羟基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有机物碳源对细胞生长抑制作用，从而使得发酵果汁最终得到的细胞浓度可以达到35. 3克/升，产物聚羟基苯烷酸酯的浓度达到12. 3克/升。但此发酵过程仅仅利用单一菌种I^seudomonas putida发酵合成含苯羟基烷酸酯共聚物，其中的单体绝大部分都是中长链(六个碳或以上)烷酸酯单体， 短链G个碳或以下，或5个碳)烷酸酯单体含量低，导致其材料难于加工成型，应用范围受到很大限制。此外，利用单一菌种微生物发酵合成含苯聚羟基烷酸酯时，因微生物特性所定，其代谢产物含苯聚羟基烷酸酯往往主要由短链单体组成，或者主要由中长链单体组成，很难调节和控制含苯聚羟基烷酸酯产物中短链单体和中长链单体的比例，以使其产物的物理化学性能难以调控，大大地限制了它的使用范围
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给来合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成的。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为，主要将两种或两种以上的微生物接种到同一发酵罐内进行混合培养，为了实现高密度发酵，整个发酵分两个阶段完成(1)第一阶段首先在发酵培养基中加入不大于0. 5g/L的含苯有机物和5 20g/ L的糖作为碳源，然后接入两种或两种以上的微生物种子液于发酵培养基中，并在发酵罐中进行发酵培养，以Ivvm的流量将无菌空气或富氧气体(如工业级的氧气)连续通入搅拌釜式发酵罐内，控制发酵罐的搅拌转速为150 800转/分钟，发酵温度为微生物生长的适宜温度，发酵液中溶解氧浓度高于微生物生长代谢的需求值；并利用氨水调节PH为微生物生长的适宜PH值(如果不用氨水而用氢氧化钠溶液来调节pH值时，在发酵过程中需要补给一定量的氮源如硫酸铵，以保证发酵过程中微生物对氮的需求量)；发酵过程中利用在线信号(如溶氧浓度、PH、在线糖浓度分析仪等)判断发酵过程中碳源(糖和含苯有机物等) 的消耗量，适时流加碳源以保证微生物的生长所需碳源；(2)第二阶段当微生物细胞吸光密度达到30(600nm波长下的测量值)后，利用不含氮的碱性溶液来调节PH值，并停止补加氨水和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量逐渐降低至0. OOlmol/L，造成发酵液中氮源供给不足实现氮限制；并随时监控溶解氧浓度和 PH值的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加碳源，微生物就会将发酵液中的碳源通过微生物代谢合成转化为含苯聚羟基烷酸酯。本专利技术上述的两种或两种以上的微生物为有能力将碳源转化为含苯聚羟基烷酸酉旨的微生物，如Pseudomonas oleovorans (食油假单胞菌),Pseudomonas putida(恶臭假单胞菌)，Pseudomonas hydrogenovora,Caldimonas taiwanensi,Ralstonia eutropha(真养产碱杆菌)等中的两种或两种以上。本专利技术上述第一阶段中所述的“微生物生长的适宜温度”和“微生物生长的适宜PH 值”，因为适宜温度和PH与菌种种类有关，根据具体采用的菌种种类可以给出适宜的温和 PH值，如本专利技术采用的适宜温度可以为28 38°C，如以恶臭假单胞菌I^seudomonas putida KT2442和真养产碱杆菌fcilstonia eutropha混合培养为例，适宜pH值为7. O士2。上述所述的含苯有机物为苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的一种或一种以上混合物。上述所述的糖为葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一种或一种以上的混合。本专利技术的优点和有益效果如下1.不同的微生物可将碳源转化为不同的聚羟基烷酸酯，如Ralstonia eutropha 可将葡萄糖转化为聚羟基丁酸酯(属于短链聚羟基烷酸酯，比较脆、硬)，而I^seudomonas putida可将葡萄糖转化为聚羟基癸酸-月桂酸酯共聚物(属于中长链聚羟基烷酸酯，比较柔、有弹性)；本专利技术利用不同微生物的混合发酵，可以合成出既含有短链也含有中长链的聚羟基烷酸酯；同时通过混合碳源补给，利用不同微生物在不同碳源环境下生长代谢的差异性，可实现大范围调控产物中短链和中长链单体的比例，达到调控产物组成的目的，从而改善产物的物理化学性能，扩大产物的应用范围。2.本专利技术通过两阶段碳源补给策略，可有效地克服含苯有机物对细胞代谢生长的抑制作用，实现高密度发酵，通过增加细胞密度，提高了含苯有机物的消耗速率，从而提高了含苯聚羟基烷酸酯的生产率。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术不仅仅局限于以下实施例恶臭fi单胞菌Pseudomonas putida KT2442禾口真养产喊杆菌Ralstonia eutropha 都具有将碳源(糖类)转化为含苯聚羟基烷酸酯的能力，在此以恶臭假单胞菌I3Seudomonas putida KTM42和真养产碱杆菌Ralstonia eutropha的高密度微生物混合发酵在氮限制条件下高效合成含苯聚羟基烷酸为例，说明本专利技术的具体实施方式。上述的恶臭假单胞菌I^seudomonas putida KTM42来源于韩国科学技术院生物化学工程实验室，真养产碱杆菌Ralstonia eutropha购于英国菌种保藏中心。实施例1以表3中所述的分批流加补料发酵方案中的补料方案1实施，具体过程如下(1)第一阶段在5L发酵罐(发酵罐Model :KF_5，KOBIOTECH CO.，LTD韩国生物技术有限公司，型号KF-幻中，配制1.8L基本发酵培养基(其组成见表1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尚龙安，张艳辉，黄锦标，金志华，张蓓蕾，范代娣，
申请(专利权)人：浙江大学宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：