东亚砂藓配子体再生体系的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，包括以下顺序步骤：取经过适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到常规MS培养基上进行培养，筛选得到无菌外植体；将无菌外植体转移到常规MS+30g/L蔗糖培养基上，诱导配子体产生原丝体；将产生的原丝体转移到扩繁培养基上培养50天，再将原丝体转移到诱导产生配子体的培养基上培养70天。本发明专利技术首次建立了东亚砂藓配子体再生体系的方法，方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。技术背景东亚砂 W^Racomitrium japonicum)属紫萼藓科(Grimmiace)砂藓属 GfeCO iiri )，生于低海拔地区的岩面、岩面薄土和沙土上。广泛分布于中国的黑龙江、吉林、辽宁、河南、江西等南北各省，日本、朝鲜、俄罗斯(西伯利亚东南)、越南、澳大利亚等地也有分布。在长期的生物进化历程中，紫萼藓科中的大多数种类在群落、茎叶以及假根结构和生理上都产生了对旱生环境适应的特征。目前，在国外，苔藓植物中的小立碗藓已成为研究植物分子生物学的理想实验材料，是研究基因功能的模式植物；土生墙藓也已成为研究耐旱藓类生理生态和抗旱机理的研究模型。而有关于紫萼藓科植物的研究报道在国内外却少之又少。若能从该科植物中找到抗旱相关基因，对于研究其耐旱机制、培育耐旱新品种， 在理论和实践上都具有重要价值。东亚砂藓为紫萼藓科中的典型的小型耐旱藓类，久旱而不丧失生活力，是较好的抗旱基因的资源。野外生长的材料是否来源于同一母本不能确定， 为了获得均一、优质化的材料，更好的研究其耐旱机制，建立东亚砂藓配子体的再生体系具有重大意义，而且目前国内还没有通过组织培养成功获得东亚砂藓配子体的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种，实现为苔藓植物抗旱基因的筛选提供均一材料的目的。该方法不仅操作程序简单，而且培养成本也很低。本专利技术采用的技术方案如下(1)取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到培养基上进行培养，培养条件为光照时间12h，光照度30001UX，培养温度20士2°C ；(2)将步骤(1)得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上，培养条件光照时间10-14h，光照度3000-60001UX，培养温度20士2°C ；(3)将步骤(2)得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上，培养50天，培养条件为光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度15-280C ；(4)将步骤(3)得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上，培养70天，培养条件为光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度20士2°C。上述步骤(1)、(2)、(3)、(4)可以全部采用，或部分步骤单独采用常规1^ + 0-40g/ L蔗糖作为培养基。上述步骤(1)、(3)、(4)可以全部采用，或者部分步骤单独采用改良Beneck + 0-40g/L蔗糖作为培养基。上述步骤(1)、(3)、(4)可以全部采用或者部分步骤单独采用常规MS培养基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-苄基氨基嘌呤作为培养基。上述步骤(1)、(2)可以全部采用或某一步骤单独采用改良Knop + 0_40g/L蔗糖作为培养基。上述步骤(2)、(3)可以全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基+ 30 g/L 蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸作为培养基。上述步骤(3)、(4)可以全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基+ 30 g/L 蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤作为培养基。上述步骤(3)中的原丝体扩繁培养基还可以为常规MS培养基+ 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 萘乙酸。上述步骤(4)中的诱导配子体产生培养基还可以为改良Beneck培养基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-苄基氨基嘌呤。上述步骤(4)中的诱导配子体产生培养基还可以为改良Beneck培养基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。上述的常规MS 培养基成分为:KN03 1 900mg/L, NH4NO3 1650 mg/L，MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 170 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 30 mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, KI 0. 83 mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L，CoCl2 ·6Η20 0.025 mg/L, Na2-EDTA 37.25 mg/L，FeSO4 ·7Η20 27.85 mg/L，甘氨酸 2.0 mg/L,盐酸硫胺素0. 4mg/L,盐酸吡哆醇0. 5mg/L,烟酸0. 4mg/L,肌醇100mg/L。上述的改良Knop 培养基成分为Ca (NO3) 2 · 4H20 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, MgSO4· 7H20 250mg/L, KCl 250mg/L, FeSO4· 7H20 12.5mg/L。上述的改良Knop 培养基成分为Ca (NO3) 2 · 4H20 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, MgSO4· 7H20 250mg/L, KCl 250mg/L, FeSO4· 7H20 12.5mg/L。本专利技术的优点是方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。通过本方法能够获得遗传特性相同的材料，用于抗旱基因的筛选，为研究苔藓植物抗旱分子机理奠定基础。因而具有十分重要的意义。具体实施方式实施例1取培养一段时间后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成0. 5-lcm的小段，用洲洗洁精溶液浸泡IOmin后，用0. 02%的升汞处理45s，进行表面消毒；消毒后接种到常规MS + 0-40 g/L蔗糖、改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖培养基上，分别进行培养，培养条件为光照时间12h，光照度3000lux，培养温度20 士 2°C。培养结果如下改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖这几种培养基上，配子体染菌率特别高，主要是青霉和根霉，在此基础上加大消毒液的浓度和消毒时间，也得到同样结果，若消毒时间和浓度太高则配子体基本死亡，故以改良Beneck、Knop为基础的无机盐培养基不适合东亚砂藓无菌配子体的筛选。对于常规培养基MS而言，MS培养基+ 0-40 g/ L蔗糖上染菌率低，含有40g/L蔗糖的培养基上配子体开始褐化，其余情况对配子体生长影响不大。故最终选择常规MS培养基+ 30 g/L蔗糖作为无菌外植体筛选的最佳培养基。实施例2将实例1筛选得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上进行培养 20天左右，培养条件为光照时间12h，光照度3000lux，培养温度20 士 2°C。制备诱导配子体产生原丝体的培养基，配方组成为以下3种①常规MS培养基+30 g/L蔗糖；②常规MS培养基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-苄基氨基嘌呤；③常规MS培养基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸。常规MS 培养基成分为:KN03 1 900mg/L, NH4NO3 1650 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 170 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 30 mg/L, ZnSO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沙伟，张梅娟，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：