一种检测环境中二恶英类物质的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测环境中二恶英类物质的方法，采用大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞作为检测手段，贴壁培养24h后，加入环境样品的有机溶剂提取液或用有机溶剂溶解的化学品，继续培养72h后，通过测定EROD酶活性，以2,3,7,8-TCDD为标准化合物，绘制2,3,7,8-TCDD对H4ⅡE细胞的EROD酶活力诱导的剂量-效应关系标准曲线，进而评价样品中二恶英类化合物的毒性效应。本发明专利技术的操作简便，造价低廉，检测时间短，高通量，能够作为环境样品和可疑类二恶英化合物的快速筛查手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及环境监测
，具体涉及。技术背景二恶英类(Di0XinS，DXNS)污染物是一类具有相似化学结构、理化性质和生物效应的氯代芳香化合物，包括多氯代二苯并对二恶英(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins, PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(Polychlorinated Dibenzofurans, PCDFs)和类二恶英多氯联苯(dioxin like Polychlorinated Biphenyls，dl-PCBs)。二恶英类化学物质的毒性作用主要是通过与机体细胞内芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor, AhR)相结合(poland et al.，1982)，形成的复合物转移入细胞核与芳香烃受体核转位子蛋白(AhR nuclear translocator，Arnt蛋白)结合，形成的DXNs-AhR-Arnt复合物能与二恶英应答元件 (Dioxin Response Elements,DRE)结合，诱导特异基因表达(主要是CYP1A1)，导致毒性作用。由于二恶英与芳香烃受体接触的量与其诱导基因表达的能力在一定范围内成正比，因此可通过检测特异基因的表达产物来反映样品中二恶英的毒性当量(Toxic Equivalence, TEQ)。环境DXNs分析属于超痕量、多组分分析，基质效应复杂，定性定量检测复杂，是现代分析的难点，目前发展起来的检测技术主要包括色谱法分析测试技术、生物法快速分析测试技术和其他测试技术(Reiner，et al. 2006)。检测二恶英类化合物的生物检测法，主要有活体检测法(in vivo)、体外受体结合实验(Rec印tor binding assay in vitro)和基于离体细胞培养检测法(bioassay in vitro)。其中活体检测法是利用动物活体暴露于待测物质，通过检测体内指标性酶活来进行检测，但该法检测时间较长，造价较为昂贵；受体结合实验是基于二恶英-Ah受体结合并激活其结合DNA的特性，同构检测二恶英-Ah受体复合物或与DNA结合的复合物的量来指针样品的二恶英效应强度，但抗体较难获得；因此， 以上两种方法均不适于作为二恶英类污染物的快速筛查技术。而现用的离体生物测试方法测得的结果也不能真实地反映污染物的生物毒性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法快速简便， 成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，能够反映环境样品的类二恶英效应，并且通过标准曲线计算得到样品中二恶英类污染物的毒性当量值。本专利技术的技术方案是环境二恶英类物质能诱导大鼠肝癌细胞株H4IIE产生EROD酶，7_乙氧基-异吩恶唑酮和NADPH在氧气和EROD酶生成7-羟基-异吩恶唑酮(RF)，RF为荧光物质，以大鼠肝癌细胞株H4IIE中EROD酶为生物标记，用2，3，7，8-TCDD诱导的酶活作出剂量-效应关系标准曲线，根据此标准曲线得出待测样品的二恶英当量(TEQ量)。本专利技术检测环境中二恶英类物质的方法包括以下步骤1)大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞的培养(a)冻存在DMEM培养基中加入20%血清和10% DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞混勻液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均勻，放入冻存盒置-80°C冰箱梯度降温池以上，然后转放入液氮罐中保存；(b)复苏从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于37°C水浴，手动慢摇恒温aiiin，复苏后离心、吸去上清液，加入IOmL含15%胎牛血清的DMEM培养基，置于5% CO2的恒温箱37 °C条件下培养；(C)传代培养取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3 遍，加入消化液37°C条件下消化:3min，加入含12%胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混勻吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新鲜培养基充分，于含5% CO2的培养箱中37°C条件下培养；2)环境中二恶英类物质的检测(a)接种取步骤1)得到的生长良好的H4IIE细胞，弃去培养液，加入DMEM胰酶消化，倒置显微镜观察消化情况，消化完全后加入2mL新鲜配制的含胎牛血清和双抗的培养液终止消化，滴管轻轻将细胞吹打脱壁，吸至无菌洁净锥形瓶中添加培养基进行细胞浓度调节，混勻后取5 μ L用血小球计数板计数；按每孔2Χ IO5个细胞接种到96孔板，于含5% CO2的培养箱中37°C条件下培养Mh ；(b)上样取出上述步骤(a)得到的96孔板，弃去培养液。取无菌洁净EP管，每个EP管中先加995 μ L添加胎牛血清与双抗的DMEM培养液，再加5 μ L溶于DMSO的待测样品，另取作为溶剂对照的EP管中添加5 μ L DMS0,涡旋混勻，按照每孔100 μ L添加于96孔板中，在(X)2培养箱中暴露72h ；(c)反应取出上述步骤(b)得到的96孔板，弃去溶液，加入100 μ L新鲜配制的含 IyL ImM的ERF和0. 1 μ L IOmM的双香豆素的DMEM培养液，置于(X)2培养箱中反应60min， 60min后加入130 μ L甲醇终止反应，室温下于96孔板摇床混勻，得到反应液；(d)用酶标仪测反应溶液的荧光强度移液器吸取100 μ L反应液于酶标板中，激发波长535nm，吸收波长590nm，测荧光强度；(e)用酶标仪测反应液的蛋白吸光值将上述步骤(d)的96孔板中剩余的反应液吸出，加入120 μ L 0. 3Μ的NaOH破碎细胞lOmin，细胞破碎后吸出100 μ L，加入G250染液 200 μ L反应lOmin，于酶标仪上595nm测蛋白吸光值；(f)用酶标仪检测步骤(C)的反应液荧光强度和蛋白蛋吸光值，计算出样品的 EROD酶的活性，用5μ L溶于DMSO的不同浓度的2，3，7，8-TCDD诱导的EROD酶活作出剂量-效应关系标准曲线，将样品的EROD酶活值与标准曲线对比得到样品的2，3，7，8-TCDD毒性当量。酶活关系曲线由以下Logistic方程用最小二乘法进行拟合-J - η式中，Y =EROD 酶活性；X 2,3, 7，8-TCDD 浓度，即诱导剂量；A 最大EROD酶活值；B 回归曲线中线性区段的斜率；C 导致半数最大EROD酶活性时的2，3，7，8-TCDD标准液浓度，即EC50值；D 最小EROD酶活值方程中的四个参数A、B、C、D通过求解获得。得到的2，3，7，8_TCDD诱导的EROD酶活剂量-效应关系标准曲线如图2。待测样品EROD酶活力用样品中RF的值除以蛋白含量和反应时间表示(pmol/min/ mg protein) 0将样品的酶活值与剂量-效应关系标准曲线对比计算得到样品的2，3，7， 8-TCDD毒性当量值。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下利用大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞作为检测手段，建立一种经济高效的评价环境样品二恶英类污染效应的生物测试方法，该检测方法快速简便、成本低廉、省时省力、应用广泛， 所需样品量少，能够反映环境样品的类二恶英效应，并且通过标准曲线计算得到样品中二恶英类污染物的毒性当量值。附图说明图1为2，3，7，8_TCDD诱导的EROD酶活性剂量-效应关系标准曲线图。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芸，任明忠，张素坤，付建平，
申请(专利权)人：环境保护部华南环境科学研究所，
类型：发明
国别省市：