本发明专利技术公开了一种由珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynenma?pretiosun)aroF基因编码的DAHP合酶的异源可溶性表达方法及所用的重组载体和基因表达工程菌。该方法通过将aroF基因连接到表达载体上形成重组表达载体，并将之转化到已含有编码分子伴侣蛋白GroEL/GroES的质粒pGro7的大肠杆菌中，诱导表达后可得到可溶性的具有酶活性的DAHP合酶，之后进行分离纯化和酶活检测。本发明专利技术首次实现了珍贵橙色束丝放线菌DAHP合酶的异源可溶性表达并得到纯化的DAHP合酶；分离纯化和酶活检测的方法较之前有了较大改进。本发明专利技术对于研究珍贵橙色束丝放线菌(A.pretiosum)的莽草酸合成途径和氨基莽草酸途径有着重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种在大肠杆菌中异源表达可溶性的由珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynenma pretiosun) aroF基因编码的DAHP合酶的方法及其重组载体和基因工程菌。
技术介绍
美登素(Maytansinoid)是1972年首先从卫矛科植物美登木(Maytenus hookeri Loes)中分离得到的抗癌化合物。安莎霉素(Ansamitocin)是珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynnema pretiosum)来源的美登素衍生物，多达二十几种，临床药理实验表明该类化合物具有治疗白血病和肺癌的作用。安莎霉素是在起始单位3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)和延伸单位2_甲氧基丙二酰ACP (2-methoxymalonyl-ACP)作用下通过一系列的链起始、延伸和终止合成碳骨架，再经过一系列的后修饰合成安莎霉素。安莎类化合物的生理活性非常强，目前人们正在努力将它们开发为临床上有用的抗癌药物，例如将美登素或其衍生物与以肿瘤细胞为靶点的抗生素结合制成导弹药物。莽草酸途径是合成芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的重要途径，它的起始物质为戊糖代谢的中间产物赤藓糖-4-磷酸(erythosd-phosphate， E4P)和糖酵解过程的一个中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，二者在DAHP合酶的作用下缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物，称为3-脱氧- α -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，即DAHP，再经脱磷酸环化，形成苯环后通过脱水、加氢形成莽草酸 (shikimate)。在可以产生利福平素B的菌株Amycolatopsis mediterranei S66中发现了另一种特殊的莽草酸途径即氨基莽草酸途径(aminoshikimate pattway)，它在其早期阶段与莽草酸生物合成途径平行，在合成代谢过程中有氨基掺入，并在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。目前，在已经公布的珍贵橙色束丝放线菌(A. pretiosum)的安莎合成基因簇的基因中尚未发现氨基DAHP合酶(amino-DAHP合酶)的基因，因此，莽草酸途径和氨基莽草酸途径的第一分歧DAHP合酶和氨基DAHP合酶的差异是否存在值得质疑。另外，一些有趣的问题例如DAHP合酶是否同时发挥着氨基DAHP合酶的作用以及amino-DAHP中的氨基基团是怎样引入的等都值得我们进一步深入探讨。DAHP合酶的进一步研究和应用有许多问题尚待解决。DAHP合酶的异源可溶性表达是解决这些问题的关键一环，但是目前还未能实现 DAHP合酶的异源可溶性表达，不能大量获得具有酶活性的DAHP合酶。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对目前某些外源基因如珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynenma pretiosun) aroF基因编码的DAHP合酶无法实现异源可溶性表达的现状， 提供一种外源基因在大肠杆菌中异源可溶性表达的方法及其所用的重组载体和表达菌株以及重组蛋白的纯化和检测方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下本专利技术的技术方案之一是一种外源基因在大肠杆菌中异源可溶性表达的方法，包括以下步骤，构建表达重组外源蛋白的表达载体，该重组表达载体与表达分子伴侣 GroEL/GroES的载体共同转入大肠杆菌表达菌株中从而获得可溶性表达外源蛋白的大肠杆菌基因表达工程菌，进行共表达。本专利技术中，所述的外源蛋白是常规蛋白，优选来自珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶。所述的DAHP合酶优选氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的外源蛋白的编码基因可以是常规，优选来自珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynnema pretiosum)中编码DAHP合酶的aroF基因。所述的aroF基因优选核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)是常规，优选珍贵橙色束丝放线菌(A. pretiosum)ATCC 31565。本专利技术中，所述的表达分子伴侣GroEL/GroES的载体是常规，只要能够在大肠杆菌中表达分子伴侣GroEL和GroES即可，优选pGro7质粒。本专利技术中，所述的大肠杆菌表达菌株是常规的大肠杆菌表达菌株，优选E. COli BL21(DE3)。本专利技术中，所述的重组外源蛋白带有His-tag标签或者其他的纯化标签，也可以不带纯化标签，本专利技术优选带有His-tag标签，便于重组蛋白表达后的分离纯化。本专利技术中，所述的表达重组外源蛋白的表达载体优选在大肠杆菌中诱导表达的质粒，如IPTG诱导表达。较佳的，该表达重组外源蛋白的表达载体具有强启动子。强启动子可以使外源蛋白高效表达。更佳的，该表达重组外源蛋白的表达载体优选质粒pET28a。质粒pET28a插入的外源蛋白基因具有强启动子，可以进行高表达。质粒pET28a还使表达的外源蛋白具有His-tag标签，便于后续的分离纯化，并且是IPTG诱导的。本专利技术的技术方案之二是一种重组表达载体，其含有来自珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynnema pretiosum)巾IS石马 DAHP 白勺 aroF 。本专利技术中，所述的重组表达载体较佳的具有强启动子。优选的，所述的重组表达载体中具有使表达的外源蛋白具有His-tag标签的序列。该表达载体骨架可以是常规表达载体，优选质粒pEI^8a，从而形成重组表达载体pET28-aroF。质粒pET28a具有强启动子和 His-tag标签，从而可以使aroF基因高效表达和方便后续的分离纯化。本专利技术中，所述的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶的aroF基因是常规，优选核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术中，所述的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶是常规，优选氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。本专利技术中，所述的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)是常规，优选珍贵橙色束丝放线菌(A. pretiosum) ATCC 31565。本专利技术的技术方案之三是一种大肠杆菌基因表达工程菌，其同时包含表达分子伴侣蛋白GroEL/GroES的载体和本专利技术所述的含有来自珍贵橙色束丝放线菌 (Actinosynnema pretiosum)中编码DAHP合酶的aroF基因的重组表达载体。本专利技术中，所述的大肠杆菌基因表达工程菌的宿主细胞是常规的大肠杆菌表达菌株，优选大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。本专利技术中，所述的表达分子伴侣蛋白GroEL/GroES的载体是常规的能够在大肠杆菌中共表达分子伴侣蛋白GroEL和GroES的载体，优选pGro7质粒。本专利技术中，所述的大肠杆菌基因表达工程菌最优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/ pGro7/pET28-aroF。本专利技术的技术方案之四是一种制备重组珍贵橙色束丝放线菌DAHP合酶的方法， 包括以下步骤，培养所述的大肠杆菌基因表达工程菌，从培养物中获得重组珍贵橙色束丝放线菌DAHP合酶。本专利技术中，所述的大肠杆菌基因表本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：花强，韦柳静，马娜，范宇翔，刘念念，周燕，张婕，李婷兰，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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