联用酶反应过程分析法和终点平衡法测定酶底物量的方法技术

一种联用终点平衡法和酶反应动力学过程分析法处理酶反应过程数据测定酶底物量的方法；连续记录的酶反应曲线中相邻数据间信号变化超过仪器噪声两倍者为有效数据；测定加入少量酶液前的检测信号，校正酶液稀释效应得校正后起点信号；酶反应曲线中有效数据不多于7个或校正后起点信号与所记录最后数据之差绝对值小于仪器噪声50倍时用终点平衡法确定反应终点信号，有效数据多于七个、校正后起点信号与所记录最后数据之差绝对值大于仪器噪声50倍且底物消耗比例达到要求时用酶反应过程分析法预测反应终点信号；用校正后起点信号与反应终点信号之差的绝对值为测量指标，据标准品响应曲线确定待测底物浓度；该方法适用于可连续监测的不可逆酶反应体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于临床检验、卫生检验等领域酶法分析测定酶底物量的数据处理方法；其特征是独立测定加入酶启动反应前的检测信号为未校正起点信号，校正随后加入的工具酶溶液稀释效应得到校正后起点信号；据连续监测酶反应曲线中有效数据量、底物消耗比例和校正后起点信号与所记录最后信号之差绝对值三个特征选择用终点平衡法还是用酶反应过程分析法分析数据确定反应终点信号，以校正后起点信号和反应终点信号之差为反应体系底物消耗造成的检测信号净变化；优化工具酶活性、记录酶反应曲线的时间和记录间隔，使不高于终点平衡法线性上限90%底物浓度对应酶反应曲线可用反应过程分析法预测反应终点信号，即两种数据分析方法可测线性范围存在交叉；两种数据分析方法建立反应体系检测信号净变化对底物浓度响应完全相同，就使得两种方法的线性响应线段连成更宽的线性相应范围；其应用优势是保障高分析效率且工具酶消耗低成本的条件下可测线性范围更宽，而此前的所有酶法分析测定底物的数据方法在相同实验测定条件下的可测线性范围都较窄。
技术介绍
酶法分析测定底物量广泛用于临床检验和卫生检验等领域。经典酶法分析测定底物量主要有两种方法学，需对应的信号测量和数据处理方法 0第一种是终点平衡法，其分别测定启动酶反应前反应体系的检测信号和酶反应完全后反应体系的检测信号，以二者之差为酶反应消耗底物造成的检测信号净变化(附图1)，而且这种检测信号净变化同待测底物浓度成正比。第二种是经典动力学法，其利用底物浓度较低时初速度同底物浓度成正比，测定不同样品在相同工具酶作用下初速度推测对应底物浓度。终点平衡法的优点是实验设计和数据处理方法简单，对多种干扰因素有抗性；其缺点是工具酶用量很大才能保障分析效率和可测线性范围。经典动力学法优势是分析效率很高，但干扰因素多结果可靠性低，且可测上限受到工具酶米氏常数的限制。这些经典酶法分析方法都不够满意，实践中还需可测范围宽、效率高、 成本低、抗干扰能力强的酶法分析新方法。最近报道了一类不依赖于酶反应初速度的酶法分析动力学新方法，称为酶反应动力学过程分析法或动力学过程分析法 0该动力学过程分析法依赖于连续监测酶反应曲线；用以反应时间为自变量的积分速度方程经过恰当数据转换后非线性最小二乘拟合酶反应曲线预测反应终点信号而不直接实验测定反应终点信号；独立测定启动酶反应前的起点信号，以二者之差为5酶反应消耗底物造成的检测信号净变化。该方法属于动力学方法，分析效率高且可测上限很高，工具酶用量少而对酶活性变化及其抑制剂干扰有抗性；工具酶活性越高则在保障分析效率的条件下可测上限越高；其可测上限可高于工具酶米氏常数的几倍，也可高于仪器直接测量的最大检测信号对应的可测底物浓度；可用于存在明显产物抑制作用的工具酶反应体系，明显优于酶法分析测定底物的经典动力学方法。在酶反应过程中，检测信号变化大于仪器噪声2倍以上的数据才属于有效数据。 这种酶反应过程分析法预测反应终点信号的方法属于曲线拟合测定参数，其要求有足够量有效数据且被分析数据中底物消耗比例高于设定界限才能可靠测定参数。在此酶反应动力学过程分析法中，为保障可测上限则工具酶活性不能太低，常用记录间隔难以很短(一般为10秒左右以便多体系平行自动分析)，为保障单个样品分析效率工具酶反应时间不能太长，这些要求造成当缺乏足够有效数据用于分析时此新动力学方法不能用。所以，酶反应动力学过程分析法测量底物的下限远高于终点平衡法，这限制了此新动力学方法测定底物的实用性。另一方面，当被分析酶反应曲线中起点和终点检测信号净变化太小时，仪器噪声相对比例太大，酶反应动力学过程分析法预测反应终点信号的精度很低，这也是其明显的缺；O此酶反应动力学过程分析法测定底物量需反应起点信号和反应终点信号用于获得酶作用下反应体系检测信号净变化，其所需检测信号的指标与终点平衡法所用指标完全相同，但其通过分析工具酶反应完成前数据预测反应终点信号而不是直接实验测定反应终点信号。所以，其可用较低的工具酶活性和较短的反应记录时间获得很高的待测底物浓度可测上限。终点平衡法直接测定工具酶反应完成后信号，故需要尽可能高的工具酶活性才能保障分析效率和可测上限，但无论如何其可测上限不可能超过仪器直接测量信号的上限。分析适量工具酶作用恰当时间后的酶反应过程数据，此酶反应动力学过程分析法测定高浓度底物有明显优势，而终点平衡法测定低浓度底物有最明显优势。所以，优化实验条件连续监测工具酶反应过程，当来自反应曲线的有效数据量、底物消耗比例和反应体系检测信号净变化都满足此酶反应动力学过程分析法测定底物含量的要求时，可预测反应终点信号而不直接实验测定反应终点信号；当缺乏足够有效数据时实际上工具酶反应已经完成，就可用终点平衡法直接测定反应终点信号；只要反应体系检测信号净变化大于仪器噪声的50倍，通过酶反应动力学过程分析法测定酶底物量能有合理的精度；优化工具酶用量和反应时间可使终点平衡法线性上限对应的反应体系检测信号净变化大于仪器噪声50 倍。任何分析方法的线性测量范围都有限故线性响应部分是线段而非直线；优化工具酶用量和/或酶反应时间，使得酶反应动力学过程分析法和终点平衡法的线性测量范围存在交叉，两种方法就可联用测定酶底物含量(附图幻，从而用较低工具酶活性和较短记录时间， 获得比单用任一方法处理数据都更宽的线性响应范围。这种联用策略对相同工具酶催化下不同样品对应的反应曲线，可据反应曲线中数据特征选择用终点平衡法还是反应过程分析法确定反应终点信号；对任一实验反应曲线只需要一种数据分析方法而不需要同时用两种方法分析；两种数据处理方法联用显著拓宽了线性范围。为简化酶反应动力学过程分析方法预测反应终点信号，需将多底物反应体系中非待测底物的浓度设置在最高待测底物浓度的10倍以上，既促进反应不可逆进行，又可简化反应为单底物，便于获得所需以反应时间为自变量的积分速度方程用于酶反应动力学过程分析预测反应终点信号。对于涉及多个工具酶的反应体系，通常将除了待测底物以外的其它底物或辅助底物浓度设置在待测底物浓度最大值的10倍以上，然后列出所有工具酶参与反应的微分速度方程或米氏方程，用迭代数值积分计算模拟设定参数下的工具酶反应曲线；用不同参数组合计算的模拟酶反应曲线最小二乘拟合实验测定的酶反应曲线；对应最佳拟合的参数组合中的反应终点信号就是所需参数。因此，此联用策略对偶联酶反应体系也适用。
技术实现思路
本专利技术目的是联用终点平衡法和酶反应过程分析法，据连续监测工具酶反应曲线中数据特征判断是否可用酶反应动力学过程分析预测反应终点信号。本专利技术的技术方案可采用固定反应时间和记录酶反应曲线的间隔，优化工具酶活性使在终点平衡法上限80%左右底物浓度下的酶反应曲线适合用酶反应过程分析法预测反应终点信号；也可固定所用工具酶活性而延长反应时间，使得在终点平衡法上限80%左右底物浓度下的酶反应曲线适合用酶反应过程分析法预测反应终点信号。显然，第一种策略成本高而第二种策略效率低；实践中可根据工具酶成本考虑采用何种策略优化条件以实现两种数据处理方法的联用。此联用方法关键是使得两种方法测定底物浓度的线性范围存在交叉区域；当通过优化工具酶活性或监测工具酶反应时间实现两种方法联用后，其应用特征在于(一 )、取一定量所需缓冲液加入试管或比色杯或可连续本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，杨晓兰，龙高波，刘红博，廖娟，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：