一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法，属于电化学生物传感器技术领域。该生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与氧化还原蛋白或氧化还原酶-脱氧核糖核酸形成的复合生物活性物质层重复叠加构成。制备方法是：先制备出磷酸锆纳米片和复合生物活性物质，然后利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面。优点在于，利用层层组装方法制备生物敏感多层膜，不受需固载的生物活性物质分子大小的限制；这种生物敏感多层膜修饰电极将脱氧核糖核酸的生物相容性与磷酸锆纳米片的稳定性相结合，在高温和强酸条件下具有灵敏的信号响应、较宽的线性范围及良好的操作稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学生物传感器
，特别是涉及一种。
技术介绍
电化学生物传感器具有体积小、成本低、准确、灵敏、易操作、可现场检测等优点， 因此国内外对电化学生物传感器开展了广泛深入的研究。其中利用氧化还原蛋白或氧化还原酶与电极间的直接电子传递进行检测的第三代电化学生物传感器更是备受人们关注，是当前电化学生物传感器研究领域的热点。温度和pH值是影响氧化还原蛋白和氧化还原酶生物活性的重要因素，因此温度和pH值对相应电化学生物传感器的性能也有重要影响，当前电化学生物传感器多难以在高于室温的较高温度或强酸碱等苛刻条件下使用。目前提升蛋白或酶的耐高温或耐酸碱性能，大多采用较复杂的生物方法，如对蛋白或酶进行改性等，以提高其活性适应范围。如在文献(I)Talanta, 2009, 79 :1412-1417 中，Melek Ozkan等人通过复制耐热细菌热纤梭菌得到了热纤梭菌_乳酸脱氢酶，再利用聚吡咯和三磷酸甘油酸的聚合物，将酶固定到金电极表面上，用于在较高温度下检测人血清中的乳酸含量。这种改性后的乳酸脱氢酶在50°C时线性范围最宽，60°C时灵敏度最高，为 25°C时灵敏度的70倍以上。但是这种生物改性方法过程繁琐，对酶的要求苛刻，难以广泛应用。层状二维纳米材料具有可插层性、良好的生物相容性和化学稳定性，将其用于蛋白或酶的固定，构建化学修饰电极也受到电化学工作者的广泛关注。在文献(2) Adv. Funct. Mater, 2007,17 :1958-1965中，Ling Zhang等人将肌红蛋白插入二氧化钛纳米片层间构建蛋白质修饰电极并对其直接电化学行为进行了研究。该电极对过氧化氢具有良好的电催化活性，同时具有一定的热稳定性。但此方法提升蛋白质耐高温性能的效果有限，只是随着温度升高蛋白质活性减少幅度较小。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，即含磷酸锆纳米片、氧化还原蛋白或氧化还原酶、脱氧核糖核酸，且适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其层层组装。本专利技术生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与复合生物活性物质层重复叠加构成， 其组成可描述为(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n。其中磷酸锆纳米片带负电，厚度为1 20nm，径向尺寸为300 1500nm ；复合生物活性物质带正电，由氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸复合而成，氧化还原蛋白或氧化还原酶为肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶中的一种，脱氧核糖核酸为市售脱氧核糖核酸，如鲱鱼精脱氧核糖核酸等，氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸的质量比为4 1 2 l;n为组装的(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的层数，取值范围为1 6。本专利技术制备生物敏感多层膜的方法是利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面，具体工艺步骤为将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到浓度为20 30g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液或聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中，15 30分钟后取出，用队吹干；将该电极浸入浓度为0. 5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶中，15 30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用N2吹干；再将该电极浸入浓度为2. 5 6. Og/L的复合生物活性物质水溶液中，10 30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n多层膜修饰电极。其中浓度为0. 5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶的制备方法为将&0C12 · SH2O, 质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液I ；将质量分数为85%的浓磷酸、质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为3000 5000转/分钟的胶体磨中，反应1 2分钟后悬浊液脱离胶体磨，按照两种溶液混合后的总体积计算，各反应物料浓度分别为&0C12 · SH2O浓度为0. 044 0. 22mol/L,磷酸浓度为2. 0 10mol/L,盐酸浓度为0. 50 2. Omol/L ；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液体积占聚四氟乙烯容器体积的40 80%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在180 240°C水热处理48 192小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗涤滤饼至滤液PH值为6 7，将滤饼在50 60°C空气气氛中干燥后得到层状α-磷酸锆颗粒；按照固/液比为0.5 2. 0g/L的比例将层状α-磷酸锆颗粒加入到体积分数为0. 2 0. 4%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌8 20 小时，所得澄清溶胶即为剥离的磷酸锆纳米片溶胶，浓度为0. 5 2. 0g/L。浓度为2. 5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液的制备方法为将肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶等氧化还原蛋白或氧化还原酶中的一种用去离子水配制成浓度为2 4g/L的水溶液，按氧化还原蛋白或氧化还原酶脱氧核糖核酸的质量比为 4 1 2 1比例与脱氧核糖核酸混合，搅拌8 12小时，得到浓度为2. 5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液。本专利技术生物敏感多层膜的组装过程可采用日本岛津UV-2501PC型紫外-可见分光光度计进行监测，不同组装层数的(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸) 多层膜的紫外-可见测试结果如图1所示。多层膜中肌红蛋白的Soret吸收带出现在408. 5nm处， 与肌红蛋白溶液的吸收带位置十分接近，并且该吸收带强度随组装层数的增加线性增长， 表明多层膜的组装过程是连续均勻的。本专利技术的实施效果可以从本专利技术生物敏感多层膜修饰电极制作的电化学生物传感器看出。将本专利技术生物敏感多层膜修饰的玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/ AgCl电极为参比电极，组成电化学生物传感器。将该电化学生物传感器的三电极体系置于 0. lmol/L pH = 6. 5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，采用上海辰华仪器公司CHI660B型电化学工作站对其进行电化学性能的表征。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰玻碳电极的电化学循环伏安测试结果如图2所示，随着组装层数的增加，循环伏安曲线中氧化峰与还原峰强度增大，当组装层数超过2层时，峰强基本保持不变。将(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构筑电化学传感器，以HA为底物进行催化活性检测检测。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L pH = 6. 5PBS 中，在 20 90°C温度区间内， 温度对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极活性的影响如图3所示。从图中可以看出随着温度的升高，电极活性均保持在较高的水平在90°C仍保持了 30°C时92% 的活性，而在40 60°C温度范围内，活性均高于30°C时的活性。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极在0.lmol/L pH = 6. 5PBS中， 在不同温度下催化还原不同浓度H2O2的催化电流-浓度曲线如图4所示。修饰电极在30°C 催化H2O2的灵敏度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨文胜，海波，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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