一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测植物病菌的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。该试剂盒可以快速完成多种植物病菌的检测，而且使用的试剂和样品的量均非常少，节约检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测
，具体涉及。技术背景出入境植物种子苗木检测十分重要，植物病害又以潜隐性、调运传播风险高成为口岸检测重点。但一直以来，口岸植物种子苗木病害的检测是个难题，原因有1. 口岸检测的目标是流通商品，有检测时限的要求，但植物病害的潜隐性、不表现症状等特点决定检测需要时间长；2.植物病害带菌(毒)量低，所以要求检测技术水平高，检测方法的灵敏度高； 3.病害检测一个项目需要较长的时间，一般一个样品还要求同时检测几个病害项目，劳动强度和工作量大；4.植物病害不同的检测项目需不同的操作，对检测人员技术水平要求高 (需较深厚的专业知识背景和较高技术操作水平)5.植物病害检测项目繁多，不同检测项目需购买大量不同的检测试剂，试剂花费高。近年来，植物种子苗木病害的检测难题有加剧的趋势。口岸植物种子苗木进出口贸易量的大量增长，检测样品批次已逐年大批量增加，而且从2009年初开始，国家对高经济附加值的种子、苗木进口商品的审批法检项目增强了检疫力度，一个样品由原本几个法定检测项目，增加到十几种甚至数十种。这样花费更多的时间、更多的试剂、更复杂的人工操作、提高了工作强度并大大加大了工作量。目前的检测方法中，对植物细菌的免疫检测中，包括ELISA试剂盒和试纸条等常规检测手段，都只能同时检测一个样品的一个项目，无法提高通量。在口岸“快速通关”的要求下，面临这些问题，必须寻找一种高通量、花费少、节约人员劳动力和试剂，并且可以同时检测一个样品的多个法定检测项目，以加速口岸的通关速度，提高口岸的检测水平、更有效防控外来生物尤其是潜隐性病害的入侵。微流控技术由于其体积小，样品用量小，并且可以简单实现高通量的特点，可以方便快速的应用于免疫检测中，使用微流控技术可以高通量快速的完成多个样品的多个参数同时检测。微流控芯片具有多个平行管道，各个管道中可通入不同的蛋白，那么在第二方向上通入的蛋白就可同时与多种不同的蛋白进行反应，从而达到高通量，高信息量检测的目的。纳米技术在进二十年内飞速发展，我国的纳米技术在世界处于领先地位，但是纳米技术相关的研究多集中于基础科研，在实际生产生活中的应用仍很不足。原因是由于纳米科技领域相关的研究与实际应用直接的合作和交流不足。无法将先进技术转化为实际应用，得到更高的社会经济价值。本专利技术将具有纳米结构的薄膜结合到微流控芯片中，利用薄膜的纳米结构表面具有较大的比表面积，在上面吸附蛋白和发生免疫反应，再利用微流控的高集成度，实现高通量的免疫检测分析，初步应用于口岸植物病菌检测的研究中。目前，国内外还没有关于使用以纳米结构的薄膜作为基底的微流控芯片检测植物病菌的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测植物病菌的试剂盒，该试剂盒可以快速完成对多种植物病菌的检测，而且使用的试剂和样品的量均非常少，节约检测成本。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种使用本专利技术所述试剂盒检测植物病菌的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是一种检测植物病菌的试剂盒，该试剂盒包括微流控芯片、植物病菌抗体、特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记的二抗、植物病菌阳性对照和显色底物；其中，所述微流控芯片包括芯片底板、设有管道的微流控芯片基片和径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜。进一步地，所述植物病菌为玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌或洋葱腐烂病菌中的一种或几种。进一步地，所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。进一步地，所述芯片底板和微流控芯片基片的材料均为聚二甲基硅氧烷。本专利技术还一种使用权利要求1所述试剂盒检测植物病菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)芯片组装将径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜平整放置在芯片底板上，所述滤膜与芯片底板之间没有气泡，然后将设有管道的微流控芯片基片放置在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上，所述微流控芯片基片与滤膜之间没有气泡；(2)使用PBS溶液分别稀释植物病菌的阳性对照和植物病菌样品，然后将稀释后的溶液分别通入微流控芯片基片的管道，孵育5-60分钟，形成植物病菌阳性对照及样品条带， 孵育结束后抽出溶液，将上层微流控芯片基片揭下；(3)在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上滴上封闭溶液，封闭10-60分钟，然后将封闭溶液洗去，所述封闭溶液为5%BSA ；(4)在垂直于步骤(2)所述的植物病菌阳性对照及样品条带上放置另一个微流控芯片基片，然后向管道内通入相应植物病菌抗体，孵育5-60分钟，孵育结束后抽出抗体溶液，将上层微流控芯片基片揭下；(5)在所述径迹刻蚀聚碳酸酯滤膜上滴上特异性结合植物病菌抗体的碱性磷酸酶标记二抗，孵育5-60分钟，将二抗溶液洗去，最后使用显色底物显色；(6)在显微镜下观察和拍摄图像。进一步地，所述植物病菌为玉米细菌性枯萎病菌、通用型瓜类细菌性果斑病、马铃薯环腐病菌、番茄细菌性溃疡病菌或洋葱腐烂病菌中的一种或几种。进一步地，所述显色底物为四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。本专利技术的有益效果1.检测时间原有ELISA试剂盒检测方法中检测每一步孵育时间至少需要30分钟到1 小时，芯片检测可以将这个过程缩短到每一步5分钟到10分钟。2.检测试剂用量使用微流控芯片所需要的样品和试剂量为1微升(常规ELISA 实验为100微升)，试剂(检测抗体)浓度为常规ELISA实验浓度的10倍，使用常规试剂量的 1/10可以进行多个细菌样品的检测。成本降低为常规ELISA的1/50。试剂用量少对于样品的优点在于某些珍贵样品可以只用很少的量得到结果，对于抗体试剂的优点在于可以比较少的试剂用量可以减少昂贵试剂的使用量从而降低成本。3.检测集成度管道可以设计成任意的数量(1到100或者更多)，由于交叉点阵反应，第二次加上的芯片可以确定检测参数的量(1到100或者更多)，所以可以根据检测需求做成同时检测多个样品的多个参数。4.本专利技术所述试剂盒，可以同时进行多种植物病菌的检测，也可以针对一种植物病菌，测定不同来源的样品。附图说明图1微流控芯片管道设计图；图2五种植物病菌在微流控芯片上的检测结果。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但这些实施例仅限于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。试剂1.玉米细菌性枯萎病菌(erwiniastewartii)抗体试剂盒，包括玉米细菌性枯萎病菌抗体，AP (碱性磷酸酶)标记二抗，玉米细菌性枯萎病菌阳性对照；通用型瓜类细菌性果斑病(西瓜果斑，Acidovorax avenae subsp. Citrulli)抗体试剂盒，包括通用型瓜类细菌性果斑病抗体，AP标记二抗，通用型瓜类细菌性果斑病阳性对眧./、、、 马铃薯环腐病菌(clavibacter michiganensis subsp. sepidonicus)抗体试剂盒， 包括马铃薯环腐病菌抗体，AP标记二抗，马铃薯环腐病菌阳性对照；番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensi s subsp. michiganensis)抗体试剂盒，包括番茄细菌性溃疡病菌抗体，AP标记二抗，番茄细菌性溃疡病菌阳性对照；洋葱腐烂病菌(BurWiolderia gladioli p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高文娜，刘颖昳，蒋兴宇，黄魁建，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：