本发明专利技术公开了一种保护细胞连接的深低温保存方法，其中，包括如下步骤：a、MDCK细胞培养的步骤：b、将步骤a所得MDCK细胞分配为正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组；c、将步骤b中的正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、分别做滤器培养；Hsp70高表达组做滤器培养和基因转染，Hsp70+海藻糖组做滤器培养和基因转染；d、将正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组进行深低温保存；e、细胞生长及形态学观察(培养细胞显微镜观察、HE染色)；f、细胞活率测定；g、细胞连接形态与结构观察与分析；h、荧光黄实验。本发明专利技术工艺简单，使用方便，组织和器官在深低温保存后细胞连接的结构和功能能够保持其完整性，能够有效避免细胞连接受损。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及深低温生物保存
，特别涉及有利于保存组织和器的，。
技术介绍
组织和器官的深低温保存是困扰低温生物学研究领域的复杂难题。细胞连接在组织中的部位、结构和功能特殊，其对冷冻损伤的反应及冷冻损伤的保护机制也应具有其特殊性。因此，有必要对深低温保存中的细胞连接损伤特点和规律进行系统观察和研究，建立针对性的、有效的深低温保存技术方案，提高和保证组织和器官的深低温保存效果。研究表明，细胞连接可能是深低温保存过程中各种损伤因子作用靶点之一，并导致组织结构的损伤与破坏。为什么细胞连接易受损伤？首先，细胞连接通过跨细胞膜蛋白，外联相邻细胞或基质，内联细胞骨架蛋白，整个细胞连接处于细胞内、外的不同部位，在深低温保存过程中这些部位所受到的损伤压力是不同的，如水与离子运动导致的渗透压变化、降温和复温过程中细胞体积变化造成的机械张力等，增加了细胞连接组成蛋白结构的变化、破坏和变性等。另外，根据已有研究，细胞连接的胞内主要成分肌动蛋白对于冷冻损伤的敏感性极高， 较多的研究发现来源于对哺乳动物卵母细胞的深低温保存研究。然而，目前对于深低温保存后细胞连接的结构和功能完整性、损伤特点及其结果缺乏系统研究，更缺乏如何保护细胞连接免受冷冻损伤的实验研究。在降低冷冻损伤、提高复温后细胞结构与功能完整性的研究中，热休克蛋白(Hsps)作为分子伴侣在深低温保存中对保存细胞活性的保护效果得到较多研究证实。Hsps是一个蛋白质家族，具有辅助蛋白质折叠、防止蛋白质聚集和变形的功能，并辅助促进错误折叠蛋白质的降解。生理状态下Hsps低水平表达，在高温、化学因子等刺激下，Hsps表达显著提高，并在细胞内发挥保护作用。研究证实，在低温保护剂溶液中添加姜黄素可以明显提高胰岛细胞Hsp70的表达， 并明显降低冷冻复温后胰岛细胞的死亡率和功能损害；经热休克处理或基因转染提高细胞 Hsp70表达水平可显著提高冷冻复温后细胞的存活率，以及细胞对于多种损伤因子的抵抗能力，但是如何提高Hsp70高表达水平也是目前急待解决的问题。在低温保护剂研究中，海藻糖的独特作用机制和效果在多种生物材料的深低温保存中被证实。海藻糖具有稳定和保护细胞蛋白质作用，促进深低温保存中玻璃化状态的形成，抑制I IF形成。海藻糖主要通过两种机制发挥保护生物分子的作用替代氢键中的水和限制必需结合水分子，使细胞“脱水”以减少冷冻时胞内水分，稳定细胞膜和蛋白质。然而与二甲基亚砜、乙二醇等(渗透性保护剂)不同，海藻糖是一种非渗透性物质，不能透过细胞膜，只能在细胞外发挥保护作用。鉴于上述技术需要，迫切需要出现一种工艺简单，使用方便，组织和器官在深低温保存后细胞连接的结构和功能能够保持其完整性，能够有效避免细胞连接受损的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种工艺简单，使用方便，组织和器官在深低温保存后细胞连接的结构和功能能够保持其完整性，能够有效避免细胞连接受损的。为了实现上述目的，本专利技术，其中，包括如下步骤a、MDCK细胞培养的步骤b、将步骤a所得MDCK细胞分配为正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组；C、将步骤b中的正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、分别做滤器培养；Hsp70高表达组做滤器培养和基因转染，Hsp70+海藻糖组做滤器培养和基因转染；d、将正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组进行深低温保存；e、细胞生长及形态学观察(培养细胞显微镜观察、HE染色)；f、细胞活率测定；g、细胞连接形态与结构观察与分析；h、荧光黄实验；所述步骤a为MDCK细胞种植于75cm2细胞培养瓶内，37°C二氧化碳培养箱培养；培养液DMEM+10 % /胎牛血清；培养2 3天，当细胞完全汇合时，吸弃培养液，加入2mL消化液消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成单个细胞后，吸去消化液，加培养液成细胞悬液，计数细胞密度；微孔滤器培养细胞以8X IO4个/孔Q.5X105f/mL)的密度接种于微孔滤器中，微孔滤器置于M孔板，微孔滤器内外各加入400 μ L和600 μ L培养液，隔日换液，3 4 天后细胞生长达完全融合，7天后实施步骤b。步骤c中的Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组的提高Hsp70高表达的方法热刺激诱导将微孔滤器培养融合的细胞置于42°C水浴箱孵育30分钟，重新放回37°C二氧化碳培养箱恢复正常培养，分别继续培养12 J4和48小时后测定细胞Hsp70表达水平，确定 Hsp70高表达的时间；然后，采用上述热刺激诱导方法诱导Hsp70高表达细胞并进行深低温保存，复温后进行实验观察与检测；具体为或者，谷氨酰胺(Gln)静脉注0. 75g · kg—1，6小时后取血管(n = 8)；或者，加热处理(热休克)TEB样本培养皿置于加热板上，并加温到41°C，分别保持 15min,回复37°C条件继续培养120min，进行各项实验。或者，HSP诱导剂(谷氨酸盐)(参考H. J. Jang等，2008年):TEB培养皿中加入终浓度lOmmol/L谷氨酸盐培养12h，然后回复正常培养12小时后，进行各项实验；构建高表达Hsp70MDCK细胞系Hsp70目的基因的重组载体pLenti-Hsp70的构建，提取!fepG2肝癌细胞株基因组总DNA —设计引物、酶切并PCR扩增Hsp70片段一酶切、鉴定、克隆，构建pLenti-Hsp70质粒一pLenti-Hsp70经酶切及测序鉴定；病毒的包装制备重组病毒质粒和辅助包装原件载体质粒(pVpack VSV-G与psPAX》一无内毒素抽提一共转染细胞(按hvitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行)— 收集细胞上清液，浓缩后的慢病毒浓缩液保存于-70°C备用。病毒经有限稀释后感染细胞，通过绿色荧光蛋白的表达标定病毒滴度；Hsp70细胞株筛选细胞接种到6孔细胞培养板(DMEM 不含抗生素、10%胎牛血清)—添加病毒液到细胞一24小时后换液处理；感染48小时荧光显微镜检查GFP表达；96小时开始对细胞进行换液处理，并添加浓度为500mg/L的G418进行筛选一逐步放大培养( 孔、6孔、60mm和 IOOmm 培养皿)一反复传代，Real time PCR 和 Western blotting 检测 MDCK 细胞 Hsp70 稳转细胞的Hsp70表达情况；深低温保存Hsp70稳定高表达的MDCK细胞种植到微孔滤器，按步骤a细胞培养条件培养，并进行深低温保存。步骤d为制备低温保护溶液(CPM)A 深低温保存组的CPM (无海藻糖)1 号 CPM :5% (w/w)Me2S0+DMEM 培养液；2 号 CPM 10 % (w/w) Me2S0+DMEM 培养液。B 海藻糖组的CPM 深低温保存组的CPM中加入海藻糖，海藻糖浓度分别为 0. 25M, 0. 5M 禾口 1. OM 三组 CPM，即0. 25M 组(1 号5% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖，2 号10% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖)0. 5M 组(1 号5% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖，2 号10% Me2S0+DMEM本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王沛涛，
申请(专利权)人：青岛大学医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：
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