本发明专利技术涉及一种聚乙二醇修饰物的分离纯化介质及分离纯化方法，所述分离纯化介质为一种聚合物微球，微球内部具有200-500nm的超大孔道，超大孔占微球孔隙率的20％-80％，微球粒径为5-150μm。所述微球孔道内部及表面具有亲水覆层，亲水覆层可衍生成不同的功能化介质，所述方法可以在高达612-3056cm/h以上的线性流速下进行分离，介质的渗透性能良好，有效蛋白载量高，对于聚乙二醇修饰物的分离效果远远优于最常用的SP?Sepharose?6FF介质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分离纯化介质及分离纯化方法。具体的，本专利技术涉及。
技术介绍
随着生物技术的发展，越来越多的生物药物被开发利用，全球生物药物的销售额逐年增长，09年达到1300多亿美元。其中，蛋白质/多肽药物在治疗人类重大疾病上发挥着越来越重要的作用。然而这些由氨基酸组成的多肽/蛋白质药物在体内注射给药时，不可避免地受到肾小球的过滤清除、酶的降解、抗体-抗原反应的影响，导致药物体内循环半衰期短，治疗中需要多次给药，增加了病人的痛苦和住院费用。针对蛋白质、多肽药物的这一缺陷，目前最有效的解决办法之一就是进行聚乙二醇修饰。聚乙二醇修饰是将活性聚乙二醇(PEG)分子与蛋白质/多肽药物偶联起来，其中 PEG是FDA批准的为数不多的医用高分子，它具有较大的水合半径和空间位阻，能够有效增加药物的分子尺寸，减少肾小球的过滤和蛋白酶的降解，延长药物的体内循环半衰期，提高药物疗效，减少给药频率，进而提高病人的生活质量。蛋白质或多肽药物经过聚乙二醇修饰后，需要进行分离纯化才能得到目标产物， 但是聚乙二醇修饰后，分子量和水力学半径的增加等理化性质的改变也带来分离纯化的困难。文献中有关蛋白质、多肽药物聚乙二醇修饰方法的研究很多，而对于同样重要的分离纯化介质的研究却很少。例如，Pabst等使用常用的琼脂糖阴离子交换介质SP Sepharose 6FF分离PEG_BSA(PEG修饰的牛血清白蛋白)，当流速为250cm/h 时，动态载量为13. 6mg/ml,比未修饰的BSA降低了 3-4倍。对于另一种色谱介质Fractopr印 TMAE (Merck,孔径43. 4nm)，PEG-BSA的动态载量仅为0. 6mg/ml，与未修饰的BSA的动态载量(113. 5mg/ml)相比，降低了近百倍。另一个例子是对于聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-GCSF)的分离纯化，使用商品化SP Sepharose 6FF介质，其载量很低，不足 5mg/ml。为了实现有效分离，流速一般为lOOcm/h左右。CN 1903890A公开了一种超大孔聚合物微球的制备方法及其产品，其在含有单体的油相中添加高含量的表面活性剂，将含有单体和表面活性剂的油相分散到水相中，通过悬浮聚合，制备出超大孔微球，所述微球的粒径为1 200 μ m，孔隙率为10% 90%，内部具有两种孔分布，一种是1 60 μ m的超大孔，另一种是10 200nm的小孔，其适合作为液相色谱固定相基质、高效催化剂载体及高效吸附剂，特别适合作为分离生物大分子的分离介质。US 2010065500A1公开了一种超大孔聚合物微球及其制备方法，所述微球的孔径中，10 60%分布在500-900nm，其粒径在1-200 μ m，孔隙率在30% 90%。所述超大孔聚合物微球，适合作为液相色谱固定相基质、疏水相互作用介质、细胞载体、高效催化剂载体及高效吸附剂，特别适合作为分离生物大分子的分离介质基质。与上述两种超大孔微球相比，本专利技术公开的超大孔微球的孔径经过优化，其中200-500nm的超大孔道占微球孔隙率的20 % -80 %，优选为30 % -70 %，更优选为 50% -70%。由于PEG修饰物的水力半径较大，通过对孔径进行优化后，上述孔径分布更适合PEG修饰物的分离纯化，既能够达到快速、高效的分离纯化，又能够有效保持被分离物的活性和收率。超大孔微球的制备方法已经在专利CN 1903890A中予以公开，具体包括以下步骤(1)在单体和交联剂的混合液中，加入引发剂、稀释剂和表面活性剂，搅拌，直至引发剂完全溶解；(2)将稳定剂溶于蒸馏水中，配制成一定浓度的水溶液，作为水相；(3)将油相加入水相，搅拌，升温聚合；(4)反应结束后，过滤，用蒸馏水和乙醇清洗数次，将稀释剂、表面活性剂等组分洗净，干燥后，即得超大孔微球。孔径的调控方法有以下二种(1)调节油相表面活性剂的加入量，表面活性剂加入量大，孔径相应增大，反之减小；( 调节交联剂用量，增加交联剂用量，孔道减小。通过配方的调整，即可得到孔径分布符合本专利要求的微球。现有技术的微球，由于现有常用介质包括多糖类介质、多孔合成介质的孔道较小， 一般在10-30nm范围内，而聚乙二醇修饰物的尺寸较大，可达到十多纳米至数十纳米，导致聚乙二醇修饰物在介质内部的传质阻力大，进入介质内部的速率低或难以进入介质内部， 因而造成介质利用率低、介质的载量低。同时，为了实现有效分离，操作流速也受到限制，严重影响了分离速度和生产效率。此外，由于不同修饰度的修饰物与未修饰物的差别较小，使用现有常规介质分离时，分辨率不高，因此造成目标产物收率会有一定程度的降低。而用于聚乙二醇修饰的蛋白质通常为具有药用价值的昂贵蛋白质，分离纯化效果的优劣直接影响了产品的成本。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，该介质可以在高流速下实现聚乙二醇修饰物的高效快速分离，可在线性流速为306-3056cm/h的范围内进行有效的分离纯化，渗透系数为1. 5 X 1012_3. 0 X 1012，介质的线性压力-流速范围为0-6112cm/h。所述聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质为一种聚合物微球，微球内部具有 200-500nm的超大孔道，超大孔占微球孔隙率的20% -80%，优选为30% -70%，更优选为 50% -70%，微球粒径为 5-150 μ m，优选为 30-100 μ m。本专利技术所述的聚合物微球作为分离介质使用，主要是由于其独特的物理结构，与其材料的选择以及制备方法相关不大。对于所属
的技术人员来说，根据其掌握的专业知识，可以在不付出创造性劳动的前提下，根据具体用途和要求，从现有技术中自由选择材料及制备方法。由于所述材料及制备方法均是现有技术，本专利技术不再就此赘述。所述微球表面具有亲水覆层，亲水覆层根据具体要求进行化学衍生，以修饰上功能基团。所述亲水覆层衍生后的功能基团包括阳离子基团、阴离子基团、疏水基团、亲和基团或金属螯和基团，或其混合物。所述基团包括磺酸基(SP型)、季铵基⑴型)、羧甲基 (CM型)、二乙氨基乙基(DEAE型)、长碳链[-(CH2)n-CH3,η = 3-20)、苯基、谷胱甘肽(GST)、 Ni-金属螯和、Cu-金属螯和、Zn-金属螯和、Protein A, Protein G等或其混合物。微球表面的亲水覆层可以物理吸附于微球，也可以通过化学键合作用固定于微球表面。化学键和方法可以对亲水分子或聚合物微球进行化学修饰，促使两者反应。固定于微球表面的亲水覆层用交联剂进一步交联，以提高覆层稳定性。交联剂可以选择环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4- 丁二醇醚及含有活泼卤素化合物等多官能团化合物中的一种或至少2种的混合物。亲水性覆层物包括琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶或其混合物。所述混合物优选由至少2种组成，例如琼脂糖和葡聚糖，聚乙烯醇和壳聚糖，明胶、海藻酸盐和胶原等。本专利技术所述聚乙二醇修饰物，包括聚乙二醇修饰的蛋白、多肽、核酸、多糖、酶、化合物，特别包括重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白介素、重组人干扰素、门冬酰胺本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马光辉，苏志国，雷建都，周炜清，翟艳琴，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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