核酸分析制造技术

本发明专利技术公开了从生物样品中提取高质量核酸的方法。通过本文所述的方法获得的提取物的特征是高产率和高完整性，使得所提取核酸对优选高质量核酸提取物的各种应用有用，所述的应用为，例如对医学病况的诊断、预后或治疗评价。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人或其他动物受试者的核酸分析的总体领域，特别是来自生物样品， 特别是微泡的高质量核酸的获取和分析。
技术介绍
细胞脱落的小微泡称为“外来体(exosome) ” (Thery等人，2002)。有报告表明外来体直径约为30-100nm，许多不同类型的细胞在正常和病理状态下都可以脱落外来体 (Thery等人，200 。外来体通常由晚期内涵体膜向内内陷和夹断形成。这导致载满小脂质双层囊泡(直径为 40-100nm)的多泡体(MVB)形成，每个小脂质双层囊泡都含有母细胞的细胞质样品(Moorvogel等人，2002)。MVB与细胞膜的融合导致这些外来体从细胞中释放出来，并递送到血液、尿或其他体液中。另一类源自细胞的囊泡称为“脱落微泡”(Cocucci等人，2009)。由细胞质膜直接出芽形成的这些微泡的尺寸比外来体的尺寸更不均勻，并且像外来体一样，也包含母细胞的细胞质样品。外来体和脱落微泡可以利用超速离心和超滤分离技术共分离，因此统称为微泡。最新研究揭示微泡内的核酸具有作为生物标记的作用。例如，Skog等人除了描述其他内容之外，还描述了从GBM患者血清中的微泡提取的核酸在医疗诊断、预后和治疗评价中的用途(Skog等人，2008)。从微泡提取的核酸的使用被认为潜在地避开活检需要，强调了微泡生物学的巨大诊断潜力(Skog等人，2008)。在核酸生物标记的研究和开发以及工业应用中，希望以一致且可靠的方式从生物样品中提取高质量核酸。本专利技术提供了来自微泡和其他生物样品的高质量核酸提取物组成、制取此种提取物的方法，和在各种应用中使用这些高质量核酸的方法。专利
技术实现思路
在一个方面，本专利技术是来自一个或多个分离自真核生物样品的微泡的新核酸提取物，其中可在该提取物中检测到18SrRNA。优选地，可在该新提取物中检测到的18S rRNA与^S rRNA的定量比率在约1 1 约1 2的范围内，优选为约1 2。可从中获取该新提取物的生物样品包括，尤其是任何体液，优选尿、血清或血浆，优选来自哺乳动物，特别是人。对于蛋白质浓度低于10mg/ml的体液样品，如尿，该新核酸提取物可进一步包含RNA完整性(在所有情况下，如在Agilent BioAnalyzer或其等效物上获得的)大于或等于5的核酸提取物，和/或可以进一步包含来自20ml生物样品的大于或等于50pg/ ml的核酸产量。类似地，对于蛋白质浓度大于10mg/ml的体液样品，如血清或血浆，该新核酸提取物可以进一步包含大于或等于3的RNA完整性，和/或可以进一步包含来自Iml生物样品的大于或等于50pg/ml的核酸产量。在另一个方面，本专利技术是来自一个或多个分离自真核生物样品的微泡的新核酸图谱，其中可在该图谱中检测到18SrRNA。优选地，可在该新图谱中检测到的18S 『1 ^与观3 rRNA的定量比率在约1 1 约1 2的范围内，并优选为约1 2。可从中获取该新图谱的生物样品包括，尤其是任何体液，优选尿、血清或血浆，优选来自哺乳动物， 特别是人。对于蛋白质浓度低于10mg/ml的体液样品，如尿，该新图谱可进一步包含大于或等于5的RNA完整性，和/或可以进一步包含来自20ml生物样品的大于或等于50pg/ml的核酸产量。类似地，对于蛋白质浓度大于10mg/ml的体液样品，如血清或血浆，该新图谱可以进一步包含大于或等于3的RNA完整性，和/或可以进一步包含来自Iml生物样品的大于或等于50pg/ml的核酸产量。在又一个方面，本专利技术是评价来自分离自真核生物样品的微泡的核酸提取物质量的方法，其包含以下步骤(a)从微泡中提取RNA ；和(b)通过测定提取物中的18S rRNA和 28S rRNA量来测量RNA的质量。优选地，在该新方法中测定的18S rRNA与^S rRNA的定量比率在约1 1 约1 2的范围内，优选为约1 2。该新方法可以在其上执行的生物样品包括，尤其是任何体液，优选尿、血清或血浆，优选来自哺乳动物，特别是人。对于蛋白质浓度低于10mg/ml的体液样品，如尿，该新方法可以进一步产生具有大于或等于5的RNA 完整性的核酸提取物，和/或可以进一步产生来自20ml生物样品的大于或等于50pg/ml的核酸产量。类似地，对于蛋白质浓度大于10mg/ml的体液样品，如血清或血浆，该新方法可以进一步产生具有大于或等于3的RNA完整性的核酸提取物，和/或可以进一步产生来自 Iml生物样品的大于或等于50pg/ml的核酸产量。在进一步方面，本专利技术是从生物样品中获取核酸的方法，其包含以下步骤(a)获取生物样品；(b)在该生物样品上执行提取促进操作；和(c)从该生物样品中提取核酸。该提取促进操作由以下步骤组成(a)向该生物样品中添加一种或多种促进剂；或(b)在提取核酸之前执行一个或多个促进步骤；或(c)添加促进剂和促进步骤相结合。该促进剂可以包括(i)RNA酶抑制剂；(ii)蛋白酶；(iii)还原剂；(iν)诱饵底物(decoy substrate)， 如合成RNA ； (ν)可溶性受体；(vi)小干扰RNA ； (vii)RNA结合分子，如抗-RNA抗体、伴侣蛋白，或RNA酶抑制蛋白；(ix)RNA酶变性物质，如高渗透压溶液或去污剂。该提取促进步骤可以包括(x)洗涤；(xi)对样品中的RNA酶进行粗细分选；(xii)通过物理变化，如通过降低温度，或执行冷冻/解冻循环使RNA酶变性。该新方法可以在包括尤其是任何体液，优选尿、血清或血浆，优选来自哺乳动物，特别是人的生物样品上执行。在一个实施例中，从该生物样品获取衍生物，并在提取核酸之前对该衍生物执行提取促进操作。优选地，该衍生物是来自生物样品的微泡组分。在一个实施例中，该微泡组分通过过滤浓缩技术获得，但也可以利用其他已知分离技术。在本专利技术方法的进一步方面，在对该衍生物执行促进提取操作之前，可以用核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、或它们的组合对它进行处理。在一些方面，该提取促进操作包括在提取核酸之前在该生物样品中，或在该衍生物中加入RNA酶抑制剂；优选该RNA酶抑制剂在样品等于或大于1μ 1时具有大于0.027AU(1X)的浓度；可替换地，在样品等于或大于1μ 1时具有大于或等于0. 135AU(5X)的浓度；可替换地，在样品等于或大于1 μ 1时具有大于或等于0. 27AU (10Χ)的浓度；可替换地，在样品等于或大于1 μ 1时具有大于或等于0. 675AU(25X)的浓度；可替换地，在样品等于或大于1 μ 1时具有大于或等于 1.35AU(50X)的浓度，其中该IX蛋白酶浓度涉及这样的酶解条件，其中利用0. 027AU或更多蛋白酶处理从1 μ 1或更多体液中分离的微泡；5Χ蛋白酶浓度涉及这样的酶解条件，其中利用0. 135AU或更多蛋白酶处理从1 μ 1或更多体液中分离的微泡；IOX蛋白酶浓度涉及这样的酶解条件，其中利用0. 27AU或更多蛋白酶处理从1 μ 1或更多体液中分离的微泡；25Χ蛋白酶浓度涉及这样的酶解条件，其中利用0. 675AU或更多蛋白酶处理从1 μ 1或更多体液中分离的微泡；50Χ蛋白酶浓度涉及这样的酶解条件，其中利用1.35AU或更多蛋白酶处理从 1 μ 1或更多体液中分离的微泡。优选地，该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷莱塔·M·鲁索，凯文·C·米兰达，约翰·斯科格，
申请(专利权)人：总医院有限公司，
类型：发明
国别省市：