本发明专利技术涉及一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，其由下述方法制得：①制备刀豆素A亲和层析柱，备用；②取血清，离心后取上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5～5ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2h；然后离心弃流出液，加入含甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育，离心并收集洗脱液；③在洗脱液中加入丙酮至终浓度为80%，-20℃过夜，离心弃上清，室温干燥后用蛋白裂解液溶解即可检测ConA-pCD。结果证实：血清ConA-pCD是一种潜在的、具有临床应用前景的新型肝癌诊断的血清标志物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物技术应用领域，具体涉及一种从血清中分离纯化得到的与刀豆素A 特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD及其在制备血清学诊断肝癌试剂中的应用。
技术介绍
肝癌是世界上六大常见的恶性肿瘤之一，每年全世界约有50 100万的新发病例。初次确诊的肝癌患者中，仅有10 30%的病例适合治愈性治疗(如采用外科手术、射频消融术及原位肝脏移植术)。不仅如此，肝癌病人预后极差，5年生存率低于5%。影响肝癌病人长期存活的主要原因之一是大多数肝癌患者确诊时已发展至中晚期，而中晚期肝癌的治疗效果极差。显然，提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率的关键在于早期诊断和治疗。因而，对肝癌易患人群(慢性肝硬化患者、乙肝及丙肝病毒携带者)进行随访、定期筛查，是检出早期肝癌的有效手段。目前肝癌高危人群筛查的主要手段是对高危人群定期(每6个月)进行B超影像学和血清学甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)的检测。然而，B超影像扫描诊断肝癌的临床应用价值有限，包括高度依赖于操作者的专业技能、检出病灶的最小直经为3cm并且难以辨别增生结节的良恶性；而其它的影像学技术，如多层螺旋CT、钆贝葡胺增强MRI，由于诊断肝癌时费用昂贵、检查费时，不适于常规高危人群筛查。尽管血清AFP检测已广泛应用于高危人群普查，但其诊断肝癌的敏感性和特异性分别为39-65%、76-94%，尤其在早期肝癌诊断中其敏感性更低(30-40%)，而不适于肝癌高危人群监测。近年来的研究发现了许多新的肝癌血清学诊断标志物，如甲胎异质体(AFP-L3)、异常凝血酶(DCP)、高尔基体蛋白(GP73)、 碱性磷酸酶肝同工酶、肝癌特异性Y谷氨酰转肽酶等，因而有学者提议这些新的标志物单独应用或与AFP联用，对肝癌易患的高危人群进行监测。然而，这些肝癌相关的新型标志物的敏感性和特异性仍不理想，如AFP-L3和DCP诊断肝癌的敏感性和特异性分别为61-75%、 90%,但AFP-L3与肝癌高度恶性和低分化密切相关，DCP对早期肝癌(< 2cm)诊断的敏感性仅为56. 5%，阻碍了它们用于肝癌高危人群监测。因此，亟需研发、鉴定肝癌诊断的新型血清标志物。蛋白质糖基化修饰是最常见的蛋白质翻译后的修饰之一，人体内约有50%的蛋白发生了糖基化修饰。糖蛋白的寡糖侧链赋予了蛋白质分子重要的生理功能，如蛋白构像、蛋白的运输及分类、稳定性及活性、亚细胞定位、蛋白质分子间及细胞间相互作用、识别等功能；并且还参与了许多疾病的病理过程，如蛋白质分子糖基化程度及寡糖侧链结构的变异是肿瘤及其它多种疾病形成与进展过程中的基本特性之一。蛋白质的异常糖基化见于人类多种肿瘤，并与癌细胞的侵袭、转移过程密切相关。因此，许多目前临床应用的肿瘤诊断标志物或治疗靶点多为糖蛋白，如CA125 (卵巢癌)、PSA (前列腺癌)、Her2/neU(乳腺癌)、CEA (结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌及肺癌)等。根据寡糖侧链共价结合的氨基酸残基不同，可将糖蛋白分为N -连接糖蛋白(与天冬酰胺残基酰胺氮相连)和O -连接糖蛋白(与丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基的羟基共价结合)。N -连接糖蛋白寡糖链分支增多及复杂化与肝癌的发生发展密切相关，如肝癌患者血清中触珠蛋白(haptoglobin，HP) β链的三天线型寡糖侧链增多，而肝硬化患者则以双天线型寡糖侧链为主；高度恶性肝癌的AFP寡糖侧链易发生岩藻糖基化，即AFP-L3产生；岩藻糖基化的GP73异质体诊断肝癌的敏感性提高；肝癌患者血清中α 1-酸性糖蛋白 (AAG)常发生异常岩藻糖基化修饰。日本和美国先后将AFP-L3增加为肝癌诊断的血清学标志物之一，充分证实蛋白质N-连接糖基化的变异与肝癌的发生和演进过程密切相关。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种从血清中分离纯化、与刀豆素A (Concanavalin，ConA) 特异结合的组织蛋白酶D酶原(ConA-pro-cath印sin D, ConA-pCD)及其在医学领域的应用。为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，由下述方法制得①刀豆素A亲和层析柱的制备在层析柱内加入100 1000μ 刀豆素A琼脂糖凝胶，离心后弃去流出液，然后加入1 5 ml含0. 1% (v/v) Triton X_100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育5 15 min，离心后弃去流出液，再加入1 5 ml糖蛋白结合缓冲液， 旋转摇床孵育5 15 min，离心后弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 5 mM CaCl2, 1 5 mM MnCl2, pH 6. 0 7. 2 (pH 可用盐酸进行调节)；②取血清，离心后取20 100μ1上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5 5 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2 h或于4°C 孵育10 12 h;然后离心弃去流出液，加入0.5 2 ml含200 400 mM甲基-a-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育5 15 min,，离心并收集洗脱液，洗脱2 6次；③在上述收集的洗脱液中加入-20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C放置10 12h，离心弃上清，室温干燥后即得。较好的，所述与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-p⑶由下述方法制得①制备刀豆素A亲和层析柱在层析柱内加入100μ1刀豆素A琼脂糖凝胶，离心后弃去流出液，然后加入2 ml含0. 1% (v/v) Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min，离心后弃去流出液，再加入2 ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min，离心后弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 7. 2 ；②取血清，离心后取20μ 上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为1 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育2 h或于4°C孵育10 12 h;然后离心弃去流出液，加入1 ml含200 mM甲基-a-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育lOmin，，离心并收集洗脱液，洗脱4次；③在上述收集的洗脱液中加入-20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C放置10 12h，离心弃上清，室温干燥20min后即得。步骤③所得产物可用蛋白裂解液溶解后，采用Western blot和光密度半定量方法检测ConA-p⑶的血清含量，血清中ConA-p⑶水平可用于诊断肝癌。为比较不同批次 Western blot结果，每批次^festern blot均检测从肝癌组织中提取的ConA_pCD( 10 ug刀豆素A结合糖蛋白)含量。蛋白裂解液的用量一般为25 200 μι。常用的蛋白裂解液配方有以下两种① 8Μ尿素，2% CHAPS (3-丙磺酸内盐)，15mM DTT (二硫苏糖 II),Proteinase inhibitor cocktai本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：齐义军，刘峰涛，杨永杰，刘瑞敏，林波，李涛，晁玮霞，张军，约翰逊·菲利普，马远方，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：
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