一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品，属于生物技术领域。本发明专利技术所述方法中的细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系，并经过（1）选育毒株、（2）建立毒种种子批、（3）制备细胞毒液、（4）灭活病毒、（5）洗涤与浓缩细胞毒液、（6）乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明专利技术方法具有生产工艺简单稳定、易操作、安全性高等特点，制备的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗质量高、产量大、成本低、批间差异小、安全性好、免疫效力高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗的制备方法及其制品，更具体地说涉及一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活苗的方法及其制品，属于生物
技术介绍
鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic 0varitis，DH0)是一种新近流行的、急性、高度接触性鸭传染病，其病原为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus, DHOV)，在病毒分类上属于黄病毒科的成员。该病毒感染不同日龄鸭，产蛋鸭主要表现采食量急剧下降，产蛋率急剧下降，部分鸭出现瘫痪现象。剖解病变主要表现为卵巢出血，卵泡变形、变性，卵巢、卵黄、睾丸、输卵管和输精管萎缩，肝脏表面有粟粒状结节。商品肉鸭表现为死淘率增加。新近科学研究情况在病毒分类地位的研究中，曹贞贞、张存等人通过对鸭出血性卵巢炎病毒与黄病毒属恩塔亚病毒群(Ntay a virus group，NTAV群)和乙型脑炎病毒群 (Japanese encepHalitis virus group，JEV群)中选NSl序列已知的病毒进行序列同源性分析和进化分析，发现该病毒与黄病毒科黄病毒属的巴格扎病毒的遗传距离位于病毒分类学种的水平。苏敬良、万春和、施少华等人的研究也表明分离获得的引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的核苷酸序列第9 777位与坦布苏病毒(TMUV)的同源性最高，为88. 7% ；遗传进化分析表明WR株病毒与坦布苏病毒、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、以色列火鸡脑膜炎病毒 (ITV)、恩塔亚病毒(NTAV)具有相似的祖先。在诊断方面，曹贞贞、万春和、苏敬良、滕巧泱等人报道可以采用临床症状、大体及组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法确诊该病。该病的流行情况2010年4月，自中国浙江首先发现以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病以来，先后在江苏、山东、河北、北京等省市发生类似的疾病。鸭出血性卵巢炎已经成为近期危害中国养鸭业的主要疫病之一。各种蛋鸭、樱桃谷种鸭和台湾白改种鸭均有发生，但主要见于开产蛋鸭。受染鸭群几乎100%发病，死亡率为5% 30%不等，蛋鸭产蛋率由80%以上下降至109Γ30%甚至10%以下，严重者停产，虽然产蛋率可逐渐恢复，但从发病至恢复正常，约需广2月；种鸭发病后种蛋的受精率和孵化率降低；商品肉鸭感染后死淘率明显增加。因此，该病给养鸭业带来巨大的经济损失，这使得养鸭业一度陷入绝境。疾病的防控目前，鸭出血性卵巢炎发生后，养殖户通常采用的控制措施是药物防治，大剂量使用各种抗菌素和抗病毒药，但往往无济于事，在部分鸭场甚至出现药物中毒的现象进一步增加了疫病的严重性。专家推荐的防治该病有效措施是注射疫苗，但目前尚未找到较好的疫苗株、大规模和高效价培养病毒的细胞系，疫苗评价模型尚未建立，制约着目前疫苗的开发。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其产品。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系。上述方法，它包括如下步骤(1)选育毒株将鸭出血性卵巢炎病毒鸭胚适应株在细胞系中连续传代培养3次，取传代适应毒株利用蚀斑纯化技术对其连续纯化培养三次，选取在仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系中培养效价高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株；(2)建立毒种种子批将步骤(1)所得候选株病毒接种至细胞系中，传代培养至第15 代，取第5 15代作为毒种种子批；(3)制备细胞毒液弃去形成良好单层细胞的细胞生长液，接种步骤(2)所得毒种种子批，吸附0. 5 Ih后，加入细胞维持液，继续培养，48 120h后细胞病变(CPE)达到80%以上时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量彡IO6 5 TCID5tZlml ；(4)灭活病毒取步骤(3)所得细胞毒液冻融两次后，加入细胞毒液总量(V/V)0.1 0. 2%的灭活剂，在37°C下振荡灭活16 Mh ；(5)洗涤与浓缩细胞毒液将步骤(4)所得灭活好的细胞毒液浓缩至原来体积的1/2， 然后用等量PH值为7. 0 7. 2的PBS溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复2 3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来体积的1/5 1/10，细胞毒液蛋白含量应不大于 400ug/ml ；(6)乳化向步骤(5)所得浓缩好的细胞毒液加入(V/V)4% 8%吐温80，搅拌均勻为水相，按照油相与水相的体积比1. 5 3 :1进行乳化，乳化后即得成品。上述方法，所述蚀斑纯化技术为0. 1%中性红蚀斑纯化技术。 上述方法，所述细胞生长液的组成为体积百分含量90% 92% DMEM液、8% 10% 新生牛血清，pH值调整为7. 2 7. 4。上述方法，所述接种的剂量为细胞生长液体积的0. 3% 1. 0%。上述方法，所述细胞维持液的组成为体积百分含量95% 98% DMEM液、2% 5% 新生牛血清，pH值调整为7. 2 7. 4。上述方法，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。上述方法，所述浓缩中其使用截留分子量50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩。上述方法，所述油相的制备方法为在白油中按(V/V)4% 8%加入司班80，按(W/ V) 1% 洲加入硬脂酸铝，灭菌后即得油相。一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，它采用由上述所述的方法制备而成。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果(1)鸭出血性卵巢炎病毒用本专利技术筛选的仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系进行培养，病毒适应性好、效价高；⑵经蚀斑克隆纯化筛选出的候选病毒株效价高、免疫原性好；(3)细胞毒液先灭活后浓缩，减少了强毒的扩散几率，具有更好的安全性；(4)细胞毒液灭活后用PBS去除残留的甲醛和杂蛋白，使疫苗的副作用降低，减小对鸭尤其是产蛋鸭生产性能的影响，提高了疫苗的安全性；(5)用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、 易操作、产量大、成本低、外源病毒污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的描述。实施例1病毒适应性细胞系的筛选根据病毒特性选择牛胚肾细胞系(MDBK)、仓鼠肾细胞系(BHK21)、猪肾细胞系(PK15)、 非洲绿猴肾细胞系(Vero)4种细胞系分别进行鸭出血性卵巢炎病毒HB株的传代培养，筛选鸭出血性卵巢炎病毒适应性细胞系。4种细胞均购自中国兽医药品监察所。鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122，2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒颗粒大体呈球状，直径40 60nm ；该病毒对外界环境的抵抗力较强，在4°C中存放几周，在_20°C中存放几个月，其感染力均不受影响；该病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在37°C条件下， 用0. 福尔马林熏蒸他便可把它灭活；该病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡的红细胞，可以凝集 1%鸽红血球；所述病毒可在9 13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9 10日龄鸡胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，6日龄鸡胚卵黄囊，7 8日龄鸭胚卵黄囊中培养。1实验方法用鸭出血性卵巢炎病毒HB株鸭胚适应株分别接种上述4种细胞系，连续传代本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨保收，刘月焕，何平有，徐倩倩，毛雅元，韩春华，林健，刘涛，
申请(专利权)人：瑞普保定生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。