本发明专利技术公开了一种利用出芽短梗霉同时发酵生产普鲁兰多糖和黑色素的方法，属于微生物发酵领域。通过一级种子、二级种子、发酵的过程，控制发酵参数，阶段调温的方法来利用出芽短梗霉同时发酵生产普鲁兰多糖和黑色素。本发明专利技术实现了一次发酵联产普鲁兰多糖和黑色素，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过出芽短梗霉TKPM00006，CGMCC3337发酵生产普鲁兰多糖和黑色素的方法，属于生物发酵工程领域。
技术介绍
普鲁兰多糖是出芽短梗霉(Aureobsidium pullulan)产生的胞外多糖，易溶于水， 具有非常优良的增稠作用，造膜性强、易形成良好的水溶性的可食薄膜，并且具有无毒无害、无色无味等优良特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域，是一种很有前景的工业用多糖。出芽短梗霉(Aureobsidium pullulan)细胞形态多种多样。在发酵过程中由于发酵条件和底物的不同，一般有酵母状(Y相)和菌丝体(M相)两种状态相互转变。大量研究表明酵母状细胞最有利于普鲁兰多糖的形成。国内的相关研究中筛选到了一些多糖产量高色素低的出芽短梗霉菌株，但国内生产技术与先进国家相比还有差距，原料利用率(50%左右)还不高，并且存在发酵时间过长的问题。方宣钧也通过紫外照射得到变异株ZY047，通过优化培养条件多糖转化率达到 54. 1%，色素水平较低(出芽短梗霉菌株紫外诱变及发酵条件优化)；刘娜研究了普鲁兰多糖生产菌种和发酵条件的优化，确定了菌种与发酵条件，虽然其色素水平低，但其普鲁兰多糖产量也不高(茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究)。黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，它是通过多羟基酚(极易结合蛋白)氧化而形成结构不规则的非均质的类多酚聚合体。出芽短梗霉在发酵的过程中， 伴有深绿色和黑色的色素产生，色素的产生对短梗霉多糖的提取纯化造成困难，降低其品质；黑色素除赋予出芽短梗霉某些特殊防御作用外，还具有外表修饰、抗辐射、抗氧化等功能，尤其在光吸收方面具有优良特性。现有技术中没有揭示联产普鲁兰多糖和黑色素的高产菌株，尚无文章报道利用同一出芽短梗霉菌种同时高效生产普鲁兰多糖和黑色素的工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用。该方法同时实现生产普鲁兰多糖与黑色素，使普鲁兰多糖与黑色素产量达到较高水平，从而提高了原料的利用率。为实现上述目的本专利技术所采用的的实施步骤如下(1)制备种子培养基，其水溶液组成(g/L)碳元素50. 0-120. 0，氮元素1. 0-5. 0， K2HPO4 1. 0-5. 0，NaCl 1. 0-4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，FeSO4O. 01-0. 02，pH 5. 5-8. 0，121 °C 灭菌20min ；取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；摇瓶于31°C 士 1°C，转速为180-240rpm的摇床上培养 48h，作为一级种子液；将一级种子液以体积比-5% (V/V)的接种量接种于种子培养基中，摇瓶于31°C 士 1°C，转速为180-240rpm的摇床上培养24h，作为二级种子液；(2)制备发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):碳元素80. 0-180.0，氮元素 1. 0-5. 0, K2HPO4 1.0-5.0，NaCl 1. 0—4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5, FeSO4 0. 01-0. 02, pH 5. 5-8. 0，121°C 灭菌 20min ；(3)将液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为2% -8% (V/V)，发酵搅拌速度为200-500rpm，初始发酵温度为31°C 士 1°C，24小时后将温度改为28°C 士 1°C，通气量为 0. 5-1. 0 (V/V)，罐压为 0. 01-0. 02Mpa ；发酵 60-72 小时；上述的碳元素碳源选择葡萄糖、蔗糖或麦芽汁，氮元素氮源选择玉米浆、酵母膏或蛋白胨。本专利技术中使用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan) TKPM00006, CGMCC3337，见天津科技大学申请专利，申请号为CN200910071018，专利技术名称为一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法，公开日期是2011. 02. 23。 该专利中公开了本专利技术用出芽短梗霉(Aureobasidium pul lulan) TKPM00006, CGMCC3337, 2009年10. 14日保藏。有益效果本专利技术利用优化的培养基配方，同时通过控制发酵条件，先促进菌体的生长，再改变发酵条件，促进产物合成，实现一次发酵联产普鲁兰多糖和黑色素，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。具体实施例方式以下结合较佳实施例，对依据本专利技术提供的具体实施方式详述如下实施例1(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L)蔗糖50. 0，酵母膏1. 0，K2HPO4L 0，NaCl 1. 0，MgSO4 · 7H20 0. 2，FeSO4 0. 01, pH 5. 5，121°C灭菌 20min ；摇瓶于 30°C，转速为 180rpm 的摇床上培养 48h， 作为一级种子液；(2)将一级种子液以体积比5%的接种量接种于种子培养基中。种子培养基成分同步骤一。摇瓶于30°C，转速为ISOrpm的摇床上培养24h，作为二级种子液；(3)按3% (V/V)的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升发酵培养基并接入二级种子液600毫升，其水溶液组成为(g/L)蔗糖100. 0，酵母膏 2. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 2. 5，MgSO4 · 7Η200· 2，FeSO4O. 01，pH 5. 5，121°C灭菌 20min ；前 24 小时发酵温度为30°C，搅拌速度为400rpm，通气量0. 8 (V/V)，罐压0. OlMpa ；24小时后将温度调整为28°C，其他发酵条件不变。再持续发酵60小时。(4)将发酵液处理后获得53. 3g/L的普鲁兰多糖和2. 4g/L的黑色素粗品。实施例2(1)取一环出芽短梗霉菌种接入装有100毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L)葡萄糖80. 0，蛋白胨2. 0，Κ2ΗΡ042· 0，NaCl 2. 0，MgSO4 · 7Η20 0. 2，FeSO4O. 01，pH 6. 5，121°C 灭菌 20min ；摇瓶于 31°C，转速为 220rpm 的摇床上培养 48h， 作为一级种子液；(2)将一级种子液以体积比3%的接种量接种于种子培养基中。种子培养基成分同步骤一。摇瓶于31°C，转速为220rpm的摇床上培养24h，作为二级种子液；(3)按5% (V/V)的接种量将摇瓶种子接入30升发酵罐中。在30升发酵罐中加入20升发酵培养基并接入二级种子液1升，发酵培养基组成为(g/L)蔗糖130. 0，蛋白胨 3. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 3. 0，MgSO4 · 7Η200· 2，FeSO4O. 01，ρΗ 5· 5，121°C 灭菌 20min ；前 24 小时发酵温度为32°C，搅拌速度为500rpm，通气量0. 7 (V/V)，罐压0. 015Mpa ；24小时后将温度调整为28°C，其他发酵条件不变。再持续发酵64小时。(4)将发酵液处理后获得56. 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，卢星达，敖爱华，郝华璇，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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