本发明专利技术提供了一种成本低、安全、操作简单的提取Bt杀虫蛋白晶体的方法。该方法包括发酵原液的前处理和提取蛋白质晶体。本发明专利技术的Bt杀虫蛋白晶体的提取量大，操作简单，成本低、安全，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属生物农药
技术背景苏云金芽孢杆菌UaciB^s iAtfri/wieasiABt)是重要的生物农药。1957年苏云金杆菌制剂首次上市销售，目前商品制剂已达100多种，是世界上产量最大，应用最广的微生物杀虫剂。Bt制剂产量占所有活体微生物杀虫剂的比例达90%以上。苏云金芽孢杆菌制剂以杀虫蛋白晶体为主要成份，一般认为其杀虫机制为杀虫蛋白晶体被敏感昆虫取食后，在昆虫中肠内溶解为前毒素，再经中肠蛋白酶水解形成具有杀虫活性的毒性肽，毒性肽穿过围食膜，与中肠上皮细胞刷状缘膜的结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症，从而造成昆虫全身麻痹而死。在Bt的基因工程、毒理学研究、杀虫机理以及对人类的安全性等科学研究方面都对Bt杀虫蛋白晶体提出了极大的需求。目前有一些分离纯化杀虫蛋白晶体的方法如孢子悬浮法，密度梯度离心法、萃取法、等电点沉淀法、碱裂解法等。虽然这些方法最终也能提取到杀虫蛋白晶体，但孢子悬浮法需要重复很多次，费时费力；密度梯度法提取的蛋白量少， 所费时间长，成本高，操作复杂；萃取法需要使用了高毒性的有机溶剂CCl4,不利于环境保护，生产过程也容易发生危险，而碱裂解法容易出现杀虫蛋白晶体被自身产生的碱性蛋白水解酶降解的现象。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术提供了一种成本低、安全、操作简单的提取Bt杀虫蛋白晶体的方法。本专利技术的技术方案如下，具体步骤如下(1)发酵原液的前处理苏云金芽孢杆菌发酵完毕后，将发酵液1500-3000 r/min离心1 min ；滤液经1000 r/ min、4°C离心1. 5-2min,除去沉淀；上清液通过10000 r/min、4°C离心15min，将收集到的沉淀溶于含有0. 1% (v/v)TritonX-100的生理盐水中，然后继续在10000r/min、4°C下离心 15min，沉淀用生理盐水洗涤，甩去多余水份后收集沉淀备用；(2)提取蛋白质晶体将步骤(1)收集的沉淀与PEG、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合，加水溶解形成混合液，使最终浓度分别为沉淀Mg/L、PEG 120 g/L、磷酸氢二钾90 g/L，磷酸二氢钾30g/L，边搅拌边调节混合液PH至8. 5，在1440r/min，15°C下离心2min，除去上清液，加水补足至与上述混合液等体积，然后再次加入占混合液总体积9% (w/v)的磷酸氢二钾和3% (w/v)的磷酸二氢钾进行二次萃取，在4500r/min，4°C下离心15-20 min，收集沉淀部分，加入生理盐水洗涤，收集Bt晶体蛋白质，将其溶于生理盐水中，于-20°C下冻存。步骤(2)所述 PEG 为 PEG4000。本专利技术的有益效果本专利技术的Bt杀虫蛋白晶体的提取量大，操作简单，成本低、安全，适合工业化生产。具体实施方式实施例1(1)发酵原液的前处理离心过滤目的是通过离心过滤除去豆饼粉等大颗粒杂质。苏云金芽孢杆菌发酵完毕后，将发酵液1500-3000 r/min离心1 min ；洗涤除杂将离心过滤后的过滤液通过1000r/min、4°C、2min离心，除去沉淀，然后通过10000r/min、4°C、15min过滤，将收集到的沉淀溶于4倍量含有0. l%TritonX_100的生理盐水中，然后继续在10000r/min、4°C、15min下离心，将沉淀采用生理盐水洗涤三次，最后一次将离心管倒置:3min使水流干，收集沉淀。(2)提取蛋白质晶体按如下体系称取沉淀、PEG、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合，以水溶解，使最终浓度分别为沉淀Mg/L、PEG4000 120 g/L、磷酸氢二钾90 g/L，磷酸二氢钾30g/L，混合后调PH到 8. 5.在1440r/min，15°C，2min条件下离心分层，除去最上层，以水补足体积，然后再次加入占总体积9%的磷酸氢二钾和3%的磷酸二氢钾(即每IOOml体积分别加9g磷酸氢二钾、 3g的磷酸二氢钾)混合进行二次萃取。在4500r/min，4°C,15min下离心收集沉淀部分，加入4倍量的生理盐水洗涤，收集蛋白质晶体。溶解于生理盐水中-20°C冻存。权利要求1.，其特征在于所述方法的具体步骤如下(1)发酵原液的前处理苏云金芽孢杆菌发酵完毕后，将发酵液1500-3000 r/min离心1 min ；滤液经1000 r/ min、4°C离心1. 5-2min,除去沉淀；上清液通过10000 r/min、4°C离心15min，将收集到的沉淀溶于含有0. 1% (v/v)TritonX-100的生理盐水中，然后继续在10000r/min、4°C下离心 15min，沉淀用生理盐水洗涤，甩去多余水份后收集沉淀备用；(2)提取蛋白质晶体将步骤(1)收集的沉淀与PEG、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混合，加水溶解形成混合液，使最终浓度分别为沉淀Mg/L、PEG 120 g/L、磷酸氢二钾90 g/L，磷酸二氢钾30g/L，边搅拌边调节混合液PH至8. 5，在1440r/min，15°C下离心2min，除去上清液，加水补足至与上述混合液等体积，然后再次加入占混合液总体积9% (w/v)的磷酸氢二钾和3% (w/v)的磷酸二氢钾进行二次萃取，在4500r/min，4°C下离心15-20 min，收集沉淀部分，加入生理盐水洗涤，收集Bt晶体蛋白质，将其溶于生理盐水中，于-20°C下冻存。2.根据权利要求1所述的提取Bt杀虫蛋白晶体的方法，其特征在于步骤(2)所述PEG 为 PEG4000。全文摘要本专利技术提供了一种成本低、安全、操作简单的提取Bt杀虫蛋白晶体的方法。该方法包括发酵原液的前处理和提取蛋白质晶体。本专利技术的Bt杀虫蛋白晶体的提取量大，操作简单，成本低、安全，适合工业化生产。文档编号C07K14/325GK102492027SQ201110408518公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日专利技术者刘波, 刘芸, 唐建阳, 朱育菁, 阮传清 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，阮传清，朱育菁，刘芸，唐建阳，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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