以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，属于用植物离体外植体的培养方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行愈伤组织诱导。结果表明，最适合的愈伤组织诱导培养基是MS+1.5mg/L6-BA，诱导出的愈伤组织多数为土黄色，颗粒状，硬度适中；最适合愈伤组织继代的培养基也是MS+1.5mg/L6-BA，成活率达91.25%；愈伤组织在6-BA浓度为1.0mg/L、1.5mg/L的MS培养基中，不定芽分化率分别为24.13%和23.64%；愈伤组织上诱导出的芽可长成健壮的完整植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于用植物的外植体离体培养的方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。
技术介绍
诺丽(ifori/^a ciiri/Wia)是一种生长于热带、亚热带的茜草科巴戟天属的常绿小乔木或灌木。诺丽是一种天然的水果，营养成分十分丰富，包含了人体所需的几乎所有的营养元素。诺丽在全球范围内的分布地区十分稀少，我国诺丽资源短缺，仅分布于海南及西沙群岛、台湾，近年在云南热带地区引种栽培。诺丽离体再生体系的建立对于后续的基因工程操作非常重要，但国内外的研究大多还停留在引种育苗阶段，国内外鲜见离体再生方面的报道。“诺丽(Morinda citrifolia L.)离体快速繁殖研究”是我们在中国知网CNKI数据库所检索到的文章，按照该文取诺丽种子发芽后，胚的子叶和下胚轴作为实验材料，并根据其介绍的方法，我们反复实验了 3次均未诱导出愈伤组织。而对诺丽的愈伤组织诱导及植株再生进行研究，将可为产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定 ■石出。
技术实现思路
本专利技术目的是以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行诺丽离体快速繁殖，提供一种诺丽的愈伤组织诱导及植株再生的方法。本专利技术的目的通过以下方式实现，步骤包括(1)愈伤组织的诱导将诺丽无菌苗的根切下，剪成0. 5cm Icm的小段作为外植体，轻轻接入培养基中， 并使外植体充分与培养基接触，培养基为MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 5mg/L 6-BA，接种约15天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；(2)愈伤组织上不定芽的诱导20天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约Icm时将其切下，于MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA或MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉) +1. 5 mg/L 6-BA下培养35天 40天；(3)不定芽的再生当步骤(2)中长出的不定芽长到Icm 2cm时，将其剪下，接入MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA的中培养约30天；(4)壮苗生根从步骤(3)培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约1 cm的其它带芽茎段，接种于MS 培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+0. 3 mg/L NAA中诱导生根，培养30 50天，得到完整植株；(5)移栽将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率75%的温室中炼苗7天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；以上MS培养基pH值为5.8 ；培养基均在1. 1 kg/cm2的压力、121 °C下灭菌20 min ；愈伤组织的诱导培养试验均在25士2°C和2000 Ix光照强度下进行，每天光照12h。所述的方法进一步是将步骤(1)培养诱导约观天的愈伤组织颗粒转入MS (附加 3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 5mg/L 6-BA培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤(2) (5)进行操作。本专利技术具有的效果和意义是多数植物在离体培养诱导愈伤组织时，通常需要添加NAA、IAA、2，4-天等多种生长调节剂。由于本专利技术取诺丽试管苗的根部为外植体，根部自身含有较多的生长激素，为离体培养的外植体提供了植物个体正常发育的生物学基础。因而，本专利技术在MS培养基只加入6-BA 一种生长调节剂，也能对根部愈伤组织产生诱导，得到数量较多、质量较好的愈伤组织。并且，在6-BA的三个浓度梯度中，高浓度的6-BA更利于诱导诺丽根部愈伤组织。特别是当采用6-BA浓度为1. 5 mg/L时，对根部愈伤组织达到95. 65%的诱导率，且时间较短，只需要15 天左右就开始有愈伤组织的发生。在愈伤组织诱导发芽试验中，愈伤组织在6-BA浓度较高的培养基中培养，发芽率也较高，说明6-BA浓度高有利于芽的分化；这是由于在上一步骤中6-BA浓度较高的培养基诱导出的愈伤组织质量较好，因此，在诱导发芽中有利于芽的分化。另外，愈伤组织在不更换新鲜培养基、置于原培养基中持续培养的情况下，40天左右，愈伤组织上也能陆续分化出小芽，但发芽率较低。本专利技术从根的愈伤组织的诱导、不定芽的诱导、壮苗生根到移栽获得诺丽完整植株，整个过程大约4个月，与目前已知的以诺丽种子发芽后的胚子叶和下胚轴为实验材料的诺丽离体快速繁殖方式所需时间或基本相同，甚或短于目前方式。因而，本专利技术达到了一种产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础的目的。附图说明图1为本专利技术根部形成愈伤组织生长示意图。图2为本专利技术愈伤组织继代培养生长示意图。图3为本专利技术愈伤组织上长出的芽生长示意图。图4为本专利技术诺丽完整植株生长示意图。以下结合附图对本专利技术做进一步说明。本专利技术包括但不限制于以下实施例。具体实施方式(一)本专利技术方法所用诺丽取自西南林业大学园林学院组织培养室的组培苗，取健康、无菌诺丽苗的根部为外植体。在以下方法中，进行对比的培养基分别是MS+0. 5 mg/L 6-BA ；MS+1. 0 mg/L 6-BA ； MS+1. 5 mg/L 6-BA。其中，MS培养基pH值为5. 8，并附加蔗糖3%、琼脂0. 6%。培养基均在 1.1 kg/cm2的压力、121°C下灭菌20 min。愈伤组织的诱导培养试验均在25士2°C和2000 Ix光照强度下进行，每天光照12h。药品均为国产分析纯，实验用水为超纯水。(1)不同浓度的6-BA对愈伤组织的诱导将诺丽无菌苗的根切下，剪成0. 5-lcm的小段，轻轻接入培养基中，确保充分与培养基接触。记录开始形成愈伤的时间，计算愈伤组织的诱导率，并观察愈伤组织的颜色和质地。 其中，诱导率=产生愈伤组织的外植体数+所接种的不污染的外植体数。接种15天后，陆续有细小颗粒状愈伤形成，30天后愈伤变大，颜色呈土黄色和浅绿色。试验结果表明(表1)，当6-BA浓度为0. 5 mg/L时，愈伤组织的诱导率仅为75. 51%， 愈伤组织的外观颜色为土黄色，颗粒较松散；当6-BA浓度为1. 0 mg/L时，愈伤组织的诱导率为85. 11%，愈伤组织的外观颜色大部分为土黄色、少部分为浅绿色；当6-BA浓度为1. 5 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高，达95. 65%，愈伤组织的外观颜色多为浅绿色，质地松紧合适(图1)。权利要求1.，步骤包括(1)愈伤组织的诱导将诺丽无菌苗的根切下，剪成0. 5cm Icm的小段作为外植体，轻轻接入培养基中， 并使外植体充分与培养基接触，培养基为MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 5mg/L 6-BA，接种约15天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；(2)愈伤组织上不定芽的诱导于20天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约Icm时将其切下，于MS 培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA或MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 5 mg/L 6-BA下培养；35天 40天；(3)不定芽的再生当步骤(2)中长出的不定芽长到Icm 2cm时，将其剪下，接入MS培养基(附加3%蔗糖和6%。琼脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA的中培本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝增全，吴田，谢江，张婷婷，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：
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