弓形虫总抗体免疫印迹试剂盒制造技术

弓形虫总抗体免疫印迹试剂盒，涉及一种试剂盒。设有载体板、硝酸纤维膜、弓形虫总抗体检测线和对照线；所述弓形虫总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫总抗体检测线处包被弓形虫重组抗原，在对照线处包被人Ig抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Ig抗体。制备弓形虫重组抗原；硝酸纤维素膜的点样；制备抗人Ig单克隆抗体；抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；制备免疫印迹试剂盒。检测时，所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种弓形虫总抗体检测免疫印迹试剂品.O
技术介绍
弓形虫病(Toxoplasmosis)是刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，其病原体弓形虫可寄生在人及多种动物的有核细胞内，人群及动物普遍易感。该病广泛分布于世界各地，据统计全球约有10亿人被弓形虫感染(奚琳琳，李威.弓形虫致病机理，毒力及基因型研究进展.中国病原生物学杂志，2009,4(11) :859-861.)。弓形虫病在我国分布很广泛，全国各省、市、自治区均有弓形虫感染的报道，我国正常人群平均感染率在4% 9%左右(刘敏，陈晓光.中国人群弓形虫病的流行特征分析.寄生虫与医学昆虫学报，2010，17(3) :131-134.),特殊人群如肿瘤患者、精神病患者、先天缺陷婴幼儿、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是极大多数免疫功能正常的成人或儿童被弓形虫感染后常无症状或仅有轻微症状，且多能自愈并获永久免疫力。但先天感染的胎儿、儿童以及免疫缺陷者被感染后，则预后极为严重。是造成艾滋病患者死亡的一个重要并发病。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者约有20% 80% 合并弓形虫感染，更重要的是它也是造成人类先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早产的重要病原体之一。现有的弓形虫病的诊断方法包括直接从脏器、血液、脑脊液等组织分离弓形虫进行病原学诊断，需要几天甚至几周时间，费时费力，在实际应用中价值不大。临床上常规检测主要是应用各种血清学方法，检测其特异IgG和IgM(周彬，张珏，王柯，等.弓形虫 IgG和IgM抗体双标记时间分辨荧光免疫分析的建立及其初步临床应用.中华检验医学杂志，2010，33 (010) =957-959.)，血清学方法可以诊断先天性、急性和慢性弓形虫病，但由于大多数免疫缺陷的人或动物其抗弓形虫的IgG滴度不会上升或不会出现高的IgM滴度，所以不能有效地用血清学方法对患有免疫缺陷的人或动物诊断弓形虫病。另外，在抗原消失相当长时间后血清抗体滴度才会逐步下降，所以也不能应用于治疗效果评价。目前检测IgG抗体存在较高的假阳性，而IgM抗体检测普遍灵敏度差等问题(韩靖云，刘倩，郭健.弓形虫感染实验室诊断的技术进展.检验医学，2009，M (5) :393-395.)。因此，对疾病的早期诊断帮助不大，急需建立一种具有高度敏感性，且价廉、快速、操作简单、不需特殊设备，更适合于临床的早期诊断方法。弓形虫病的诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，正常人体感染弓形虫多为隐性感染，当机体免疫力下降时，虫体大量繁殖，侵入除红细胞外的各组织细胞内寄生，造成各种组织的广泛炎症，从而出现临床症状。人类感染弓形虫后能诱导产生特异性抗体。感染早期IgM抗体增高，IgM在感染4个月后逐渐消失，在感染1个月后出现高浓度 IgG 抗体(KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitros eciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin gand immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168.)。因此，弓形虫IgG抗体是弓形虫病诊断和流行病学调查的一项重要指标。早期的血清学方法使用弓形虫循环抗原。研究和诊断用的弓形虫循环抗原是以弓形虫感染小鼠腹腔获得，这种方法花费大、获得的抗原量少且不纯(常混有宿主蛋白)， 因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及弓形虫抗原的相继克隆，将重组抗原应用于弓形虫实验已经越来越多。目前研究比较多的弓形虫的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、虫体棒状体抗原(R0P1、R0P2)、致密颗粒蛋白(GRA1、 GRA7)等(熊美华，王秀珍，刘露霞，等.弓形虫速殖子抗原的提取及蛋白分析.中国寄生虫病防治杂志，2001，14(3) :237-238.)。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整弓形虫抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组弓形虫抗原。现有的弓形虫抗体检测方法包括ELISA、WeStern-bl0t等，其特异性均较高。采用 Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完成，不需要特殊设备，判读也简单明了。现市售的Western-blot试剂均为进口试剂，价格昂贵。面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更经济实用的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。
技术实现思路
本技术的目的是提供一种弓形虫总抗体免疫印迹试剂盒。本技术设有载体板、硝酸纤维膜、弓形虫总抗体检测线和对照线；所述弓形虫总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上。在弓形虫总抗体检测线处包被弓形虫重组抗原，在对照线处包被人Ig抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Ig抗体。所述弓形虫重组抗原为SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7重组抗原。所述载体板可采用PVC板。以下给出本技术的制备方法1)制备弓形虫重组抗原采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得弓形虫重组抗原；所述弓形虫重组抗原为SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2、GRA7等。2)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜总抗体检测线上包被弓形虫重组抗原，在对照线处包被人Ig抗体，晾干；所述弓形虫重组抗原为SAGl (P30)、SAG2(P22)、R0P2、GRA7等；所述弓形虫重组抗原和人Ig抗体的浓度可为1 鈿g/mL ；点样量可为1 μ L/cm。3)制备抗人Ig单克隆抗体以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人Ig单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1 IO7以上。4)抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；所述辣根过氧化物酶的底物由0. 03% (ff/V)的过氧化氢和0.07% (W/V)的二氨基联苯胺组成。5)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，弓形虫总抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上，在弓形虫总抗体检测线处包被弓形虫重组抗原，在对照线处包被人Ig抗体，用切条机切成条状，与酶标记的抗人Ig单克隆抗体及其底物共同组装成弓形虫总抗体免疫印迹试剂盒；所述弓形虫重组抗原为SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7等。本技术提供了一种采用免疫印迹技术建立弓形虫总抗体检测试剂条，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中弓形虫总抗体的检测。该检测方法所需的标本量极小， 不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨天赐，张忠英，刘莉莉，林丽蓉，张长弓，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：实用新型
国别省市：