用于分析能量代谢中极性代谢物的方法技术

本发明专利技术涉及极性代谢物的分析并提供了用于分析极性代谢物的方法，其包括在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，通过色谱法分离提取物所包含的极性代谢物，并分析所分离的极性代谢物。此外，本发明专利技术还涉及用于淬灭包含细胞物质的生物样品的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及极性代谢物的分析并提供了用于分析极性代谢物的方法，其包括在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，通过色谱法分离提取物所包含的极性代谢物，并分析所分离的极性代谢物。此外，考虑了用于淬灭包含细胞物质的生物样品的方法。极性代谢物诸如羧化代谢物或磷酸化代谢物占细胞的代谢组物的高达90 %。相应地，代谢组学，即代谢组物的系统和比较分析，在极大程度上涉及极性代谢物的分析。目前提供的用于代谢组学的分析技术主要是基于以液相色谱或气相色谱为基础的质谱或以液相色谱或气相色谱为基础的NMR(核磁共振)谱。在代谢组学中气相色谱的应用的缺点是必须将代谢物转换成气相而不未破坏分子。应用衍生化以改善所述的转换。然而，衍生化也具有一些缺点，因为人工衍生化能产生有时几乎与真实代谢物无法区分的代谢物。液相色谱既不需要转换成气相也不需要衍生化。然而，对于极性代谢物的分离是不太有效的。此外，由于生物样品中过多的蛋白质类、肽类和无机盐的存在，对于极性代谢物的分离效能通常被显著地降低。因此，期望的是把气相色谱的精确分离特性与能被应用于液相色谱的温和的条件结合。这样，将会避免上述的缺点。因此，虽然还没有用于代谢物的有效的提取和分析的方法，但却是迫切需要的。本专利技术涉及用于分析极性代谢物的方法包括i)在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下，用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，ii)通过色谱法分离步骤i)中所获得的提取物所包含的极性代谢物，和iii)分析步骤ii)中所获得的分离的极性代谢物。本文所应用的术语“生物样品”是指包含来自所有生物来源的生物物质的样品。 应当理解的是生物物质应包括代谢物。生物样品所包含的优选的物质是细胞物质，诸如细胞或细胞碎片。因此，优选地，生物样品包含悬浮细胞、贴壁细胞或组织或它们的任何碎片。 优选的生物样品包含来自临床样品的生物物质，包括体液样品，优选血液、血浆、血清、淋巴液、汗液、唾液、泪液、精液、阴道液、粪便、尿液或脑脊液，或由例如通过活组织检查从细胞、组织或器官所获得的样品。还优选地，生物样品代表有机体的各种状况的一种，例如它可是源自健康的或患病的有机体，用药物治疗或未治疗的有机体等。还包括包含微生物诸如细菌或真菌或者植物、植物部分(诸如叶、茎、根或花)或植物种子的生物样品。本文所应用的术语“代谢物”是指小分子化合物，诸如代谢途径的酶的底物、所述途径的中间体或通过代谢途径所获得的产物。代谢途径为本领域所公知且可在种属之间不同。优选地，所述的途径至少包括三羧酸循环、呼吸链、光合作用、光呼吸作用、糖酵解、糖原异生、一磷酸己糖通路、氧化戊糖磷酸途径、脂肪酸产生和β -氧化、尿素循环、氨基酸生物合成途径、蛋白降解途径诸如蛋白酶体降解、氨基酸降解途径、脂质体、聚酮化合物(包括例如黄酮类和异黄酮类)、类异戊二烯(包括例如萜类、留醇类、留类、类胡萝卜素类、叶4黄素类)、碳水化合物类、苯丙素类及衍生物、生物碱类、苯环类、吲哚类、吲哚-硫化合物、 卟啉类、花色素类、激素类、维生素类、辅因子诸如辅基或电子载体、木质素、葡萄糖异硫氰酸盐类、嘌呤类、嘧啶类、核苷类、核苷酸及相关的分子诸如tRNA、微小RNA(miRNA)或mRNA 的生物合成或降解。相应地，小分子化合物代谢物优选地由以下几类化合物组成醇类、烷烃类、烯烃类、炔烃类、芳香化合物、酮类、醛类、羧酸类、酯类、胺类、亚胺类、酰胺类、氰化物类、氨基酸类、肽类、硫醇类、硫代酸酯类、磷酸酯类、硫酸酯类、硫醚类、亚砜类、醚类，或上述化合物的组合或衍生物。在代谢物中的小分子可以是正常细胞功能、器官功能或动物生长、发育或健康以及植物生长所必需的初级代谢物。此外，小分子代谢物还包括具有重要生态功能的次级代谢物，例如使有机体适应其环境的代谢物。此外，代谢物不局限于所述的初级和次级代谢物还包括人工小分子化合物。所述的人工小分子化合物是源自外源性提供的小分子，其通过有机体施用或摄取，但不是上文定义的初级或次级代谢产物。例如， 人工小分子化合物可以是通过动物的代谢途径从药物所获得的代谢产物。此外，代谢物还包括肽类、寡肽类、多肽类、寡核苷酸类和多聚核苷酸类，诸如RNA或DNA。更优选地，代谢物的分子量为50Da(道尔顿)至30，OOODa，最优选地小于30，OOODa、小于20，OOODa、小于 15，OOODa、小于 10，OOODa、小于 8，OOODa、小于 7，OOODa、小于 6，OOODa、小于 5，OOODa、小于 4，OOODa、小于 3，OOODa、小于 2，OOODa、小于 1，OOODa、小于 500Da、小于 300Da、小于 200Da、 小于lOODa。优选地，代谢物无论如何具有至少50Da的分子量。然而，依据本专利技术的代谢物的分子量最优选为50Da至1，500Da。在代谢物中，本专利技术面对的是极性代谢物，即为极性的小分子化合物。从生物样品提取诸如极性代谢物的分子是已公知的方法，其是基于利用分子的溶解性差别。感兴趣的分子可被提取出来，即溶解在提取缓冲液中，并因此从生物来源中移走。可以理解的是基于提取缓冲液的化学性质，可溶解不同种类的分子，并因此从生物样品物质中分离。本专利技术的方法，特别是设想从生物样品中提取极性代谢物。提取可以连续的或分批的方法进行。以生物样品为例，提取方法优选有机械破坏生物样品所包含的生物物质的帮助。这样的帮助优选允许短的和有效的提取时间，优选地小于40秒，小于30秒，小于20秒。这可通过已公知的均勻化技术实现，诸如通过例如pestilling或珠磨进行的细胞研磨，例如Jastfr印(MP生物医学，德国)。应用于本专利技术方法中的提取缓冲液包含相分离剂，即对于使分子分离至不同相 (诸如极性分子的相和非极性分子的相)中具有促进和/或改善能力的化合物。优选地，本专利技术方法所应用的相分离剂包含卤化溶剂。优选地，卤化溶剂具有大于 l.Olg/cm3(在20°C)的密度。更优选地，卤化溶剂选自二氯甲烷、氯仿或四氯乙烯，更优选地，卤化溶剂是二氯甲烷。相分离剂是高度疏水的，且优选地密度高于水，诸如二氯甲烷是本专利技术方法中优选的。这些相分离剂能够沉淀样品中的蛋白质，并因此有助于优选的基于离心方法的蛋白质干扰物的去除，否则其会干扰代谢物的后续的分析。此外，通过相分离剂的相分离是有利的，因为由于高浓度盐干扰物会使有机溶剂在水溶液中的溶解度降低。除了卤化溶剂外，相分离剂优选地还包含低级烷的醇。优选地，所述的醇是乙醇、 甲醇或异丙醇，且最优选乙醇。卤化溶剂和低级烷的醇存在于相分离剂中，优选地以3 1至1 1的比率、且优选地以2 1比率存在。然而，还优选地，相分离剂也可基本上由卤化溶剂构成。此外，提取缓冲液包含挥发性的生性铵盐。本文所涉及的挥发性中性铵盐是可通过冷冻干燥方法升华的铵盐。优选地，所述的挥发性中性铵盐是乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵。最优选地，所述中性铵盐是乙酸铵。尤其是乙酸铵促进极性和非极性代谢物的分离，因为仅极性代谢物能溶解于本专利技术的含有乙酸铵的提取缓冲液中。依据所要进行的用于分析代谢物的分析的类型，分离极性代谢物与非极性代谢物是必需的或有帮助的。这特别是应用于如果将分析含蛋白质的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·巴尔克，T·B·沃克，M·多斯特勒，R·洛塞，S·卡瓦略，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：