本发明专利技术提供了一种适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质水稻热激90蛋白质，该蛋白质在水稻不同发育时期和不同组织的材料，水稻接白叶枯病菌不同时间的材料和水稻昼夜不同时间的材料中均稳定表达，可以作为水稻免疫印迹研究的内参蛋白质。本发明专利技术还提供了水稻热激90蛋白质相应的单克隆抗体，利用体外表达的片段蛋白质作免疫原免疫Balb/c小鼠，得到的杂交瘤XXX分泌得Rice90-31单克隆抗体。该抗体能够特异的识别重组蛋白质和水稻天然蛋白质，在实验中的使用效价是1∶10000-1∶20000；本发明专利技术制备的Rice90-31单克隆抗体的线性检测范围是0.41-8.2ng，在水稻蛋白中的最低下限大约是0.24ng；利用标准曲线计算出HSP蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量大约是0.12％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种适合水稻免疫印记(Western blotting) 研究的内参抗体。
技术介绍
看家基因是指在生物体内广泛表达的必需基因，这些基因大多负责基础代谢过程，它们往往呈组成型表达，所以在进行表达量的相对比较时被作为内参基因。在生物学实验中，为了对不同样本进行比较，需要选择合适的内参基因进行样品和实验过程的校正和标准化，以便得到可靠的试验结果，所以内参基因的选择和使用具有重要意义。理想的内参基因应在各种实验条件下、在各种类型的组织或细胞中恒定表达。然而，大量的实验结果表明，内参基因的恒定表达都是“有范围”的，在超出范围的实验条件下可能是不适合作为内参的，内参基因使用不当，可能使基因表达的微小差异难以发现，甚至可能引致错误甚至相反的结论，所以对内参基因的进行筛选和评价，确定合适的使用范围是实验设计时应注意的问题。在动物转录水平研究中适合不同物种的内参基因被筛选出来人；鼠；牛；狗；马； 海豚。在植物的RT-PCR分析中，适合不同物种的内参基因也被筛选出来拟南芥、小麦、大麦、大豆、番茄、马铃薯、白杨、葡萄、桃子、咖啡、甘蔗。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，也是植物生长发育、逆境反应等基础研究的模式植物。水稻基因组测序工作的成果极大地推动了水稻相关研究的进展，带动了水稻转录组学研究，利用水稻全基因组基因芯片调查了水稻在杂种优势、逆境、发育过程中的表达谱，对特定目标基因的转录研究也经常使用RT-PCR技术，在RT-PCR 中，筛选并提出了适合水稻的内参基因UBQ5和eEF-la。水稻基因组学的成果也推动了蛋白质组学的研究，利用2DE-MASS技术对水稻发育、逆境、愈伤组织分化等进行蛋白质组学分析，鉴别了一系列的差异表达蛋白质，同时，随着水稻功能基因组学工作的开展，对水稻蛋白质功能的验证和比较研究也日益增加，免疫印迹技术因其具有灵敏度高、特异性好、 操作简便、结果直观等优点被广泛应用于检测蛋白质在不同组织中表达量的重要手段。显然，在免疫印迹技术中需要使用内参来标定上样量从而消除实验误差。然而有关医学和动物蛋白水平的定量研究中对内参蛋白质的研究表明，实际上常用的内参如Actin，GAPDH， Tubulin在蛋白水平的表达并不稳定，这就不可避免的影响对特定蛋白质功能研究的精确性，因此有必要筛选出适合水稻蛋白水平研究的内参蛋白质。然而在水稻中并没有系统的内参蛋白质筛选和鉴定工作的相关报道。为此，本专利技术人制备了 9个水稻候选内参蛋白质的抗体，比较了相应蛋白质在水稻不同发育时期/部位的表达，发现热激90蛋白质(Heat shock 90 protein)在参试条件下表现稳定性优于Actin、GAPDH和Tubulin等，更适合于作为水稻蛋白质研究的内参，进一步研究发现其表达水平在白叶枯病抗性反应中和昼夜生长过程中也没有发生变化，证明了热激90蛋白质的稳定性。在此基础上调查了热激90蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量以及其检测的灵敏度，所制备的抗体可供水稻蛋白质相关定性定量研究采用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质及其相应的抗体。本专利技术的第一个目的是筛选出一种适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质。本专利技术选取9个水稻候选内参基因，分别利用原核表达的蛋白质或合成的抗原片段制备了抗体， 用免疫印迹技术检测了相应蛋白质在水稻10个时期/部位的表达，用geNorm和Microcal Origin软件对蛋白质表达稳定度进行分析，结果证明，热激90蛋白质在水稻不同发育时期和不同组织的材料中表达稳定，热激90蛋白质在参试条件下表现稳定性优于ActiruGAPDH 和Tubulin等，更适合作为水稻蛋白质研究的内参，进一步研究发现热激90蛋白质在水稻接白叶枯病菌不同时间和水稻昼夜不同时间的材料中同样稳定表达，且水稻热激90蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量较高以及其在作为内参蛋白时的检测灵敏度高。本专利技术的另一个目的是提供一种能够分泌抗热激90蛋白质的鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞系(杂交瘤细胞株为Rice90-31，保藏号为CGMCC NO. 3986，保藏日期为2010年 07月08号。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。以原核表达的重组蛋白质热激90 蛋白质为免疫原免疫Babl/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0融合，得到的杂交瘤细胞系，经鉴定 Rice90-31细胞株分泌的单克隆抗体特异性，敏感性强。本专利技术的第三个目的是提供该单克隆抗体作为在免疫印迹实验中检测其内参热激90蛋白质的使用方法。为了验证抗体的特异性和结合强度，用抗体对重组抗原进行了免疫印迹检测；用Rice90-31抗体检测梯度稀释的重组蛋白，以重组蛋白质量为自变量，以图像信号强度值为因变量，绘制标准曲线，计算抗原抗体反应的线性范围；在其线性范围内把梯度稀释的热激90重组蛋白和水稻总蛋白一起进行免疫印迹检测，进一步绘制了更精确的标准曲线，根据标准曲线计算出热激90蛋白质在水稻总蛋白中所占的百分含量；用热激 90蛋白质抗体(Rice90-31)检测梯度稀释的水稻蛋白，计算出热激90蛋白质抗体在水稻蛋白中的最低下限。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术路线为选取9个水稻候选内参基因，预测抗原决定簇，通过合成多肽或细菌体外表达制备抗原，免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞系，进而制备单克隆抗体，用免疫印迹技术检测内参基因在水稻10个时期/部位的表达，利用geNorm和Microcal Origin 6. 0软件对看家蛋白质的表达稳定度进行排序，鉴定出热激90蛋白质适合作为水稻蛋白质研究的内参蛋白质；进一步在水稻白叶枯病抗性反应和一天内不同时间点的水稻材料中对热激90蛋白质的稳定程度进行检测；通过绘制抗原抗体反应标准曲线，计算热激90蛋白质占水稻总蛋白的百分含量及在水稻蛋白中的检测下限。实验证明，利用体外表达的片段蛋白质作免疫原得到的鼠源单克隆抗体 Rice90-31(杂交瘤细胞株名称Rice90_31，保藏号为CGMCC NO. 3986)能够特异的识别重组抗原和水稻蛋白，在实验中的使用效价是1 10000-1 20000 ；用Rice90-31抗体检测梯度稀释的重组蛋白，以重组蛋白质量为自变量，以图像信号强度值为因变量，绘制标准曲线，热激90抗原蛋白质量在0. 41-8. 2ng范围内时与图像信号强度呈线性关系；在标准曲线线性范围内将一系列梯度稀释的重组蛋白和水稻总蛋白一起进行免疫印迹检测，进一步绘制标准曲线，根据标准曲线计算出热激90蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量大约是0. 12%;用Rice90-31抗体检测梯度稀释的水稻蛋白，发现Rice90-31抗体在水稻蛋白中的最低下限大约是0. Mng。本专利技术的优点及其有益效果本专利技术提供的水稻热激90蛋白质在水稻不同发育时期和不同组织的材料中表达稳定，进一步研究发现热激90蛋白质在水稻接白叶枯病菌不同时间的材料和水稻昼夜不同时间的材料中同样稳定表达，该水稻内参蛋白质可以是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)根据序列表本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘国振，白辉，李晓明，韦汉福，潘秦，史晓儒，尹长城，吴琳，刘斯奇，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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