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识别IgG结合位点的方法技术

技术编号:7354073 阅读:224 留言:0更新日期:2012-05-19 10:55
本公开涉及具有降低的寡聚化和有效标记的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物以及组合物、产生这样的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物的方法和特别是在疾病治疗和预防中利用这样的免疫球蛋白结合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本公开涉及改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物。背景单克隆抗体具有巨大的实验和治疗用途。具有工程化位点特异性荧光或结合性质的抗体衍生物已被开发并使用了许多年。最近,抗体也已被发展为治疗剂,目前呈现最快增长的药物类别[1]。抗体是通过二硫键结合在一起的两条轻链和两条重链的多结构域蛋白质。可变区指定结合到特定抗原,恒定区部分通过结合到免疫细胞表面的Fc受体引起效应子功能。由于在各种疾病治疗中的潜力,抗体目前构成最快速增长的人类治疗剂种类(Carter.Nature Reviews Immunology.2006,6(5),343)。自从2001,它们的市场已以35%的平均年生长率增长,这是所有生物技术药物分类中最高的速率(S.Aggarwal.Nature.BioTech.2007,25(10)1097)。抗体结合物的工程化已进一步增加了抗体应用的多样性。在许多实验室技术中,酶或荧光探针与抗体结合以实现测定功能,例如抗原丰度的定量。在靶向治疗的情况下,毒素小分子连接到特异地结合患病细胞上的生物标记的抗体[2-4]。已进行了抗体结合的各种方法,例如连接到表面赖氨酸[5]、连接到Fc碳水化合物[6]或连接到部分还原的链间二硫化物[7]。抗体结合到工程化表面半胱氨酸依然是非常有吸引力的选择,因为大多数抗体不具有半胱氨酸,除了在链内和链间二硫键中消耗的半胱氨酸。小分子可在通过巯基反应化学如马来酰亚胺连接在半胱氨酸置换的特异位点[8-14]。在CH1和CH3结构域的工程化已有利避免可变区的抗原结合和CH2效应子功能的干扰。已考虑了通过工程化半胱氨酸的成功抗体结合的不同标准。例如,在其中实现突变的抗体结构域、突变位点的暴露、将被置换的氨基酸是将要考虑的几个变量。已发展了鉴定适于半胱氨酸工程改造和结合的位点的高通量筛选方法[15]。与抗体半胱氨酸变体相关的两个最常见的问题是寡聚化和弱标记。然而,没有预测是否抗体半胱氨酸变体将是稳定的和有效结合的通用工具。此外,半胱氨酸变体目前只为CL、CH1和CH3结构域存在[8,9,11,12,15]。因此,存在另外的可用于产生稳定免疫球蛋白结合物的免疫球蛋白半胱氨酸变体的需要。概述本文描述满足该需要的改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物,其显示降低的交联。因此一方面包括免疫球蛋白结合物,其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)、298(CH2)和326(CH2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白,其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换,其中原子或分子结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自254(CH2)和298(VH)的残基处。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物进一步包括具有至少两个活性位点的连接分子,其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半胱氨酸残基,第二个活性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合的某些实施方式中,连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,原子或分子选自90Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱(maytanisoid)、奥利斯汀(auristatin)、蒽环类化合物(anthracyclin)、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖(mannosyl)残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%。另一个方面包括修饰或分离的免疫球蛋白,其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)和326(CH2)残基处的至少一个突变,其中至少一个突变是用半胱氨酸残基的置换。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残基处。在某些实施方式中,至少一个突变是在残基254(CH2)处。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中,修饰或分离的免疫球蛋白包括人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.04 US 61/184,0841.免疫球蛋白结合物,其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、
248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)、298(CH2)和326(CH2)的残基处具有至少一个突变的免
疫球蛋白,其中所述至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换,其中所述
原子或分子结合到所述半胱氨酸残基。
2.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物,其中所述至少一个突变是在选自7(VH)、
20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。
3.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物,其中所述至少一个突变是在选自
248(CH2)和326(CH2)的残基处。
4.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物,其中所述至少一个突变是在选自25(VH)
和286(CH2)的残基处。
5.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物,其中所述至少一个突变是在选自
254(CH2)和298(VH)的残基处。
6.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述免疫球蛋白选自
IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
7.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述免疫球蛋白包括
IgG1。
8.权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人CH1结构域。
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人CH2结构域。
10.权利要求1-9中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人CH3结构域。
11.权利要求1-10中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人CL结构域。
12.权利要求1-11中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人VH结构域。
13.权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其包括人VL结构域。
14.权利要求1-13中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其进一步包括具有至少两
个活性位点的连接分子,其中第一个活性位点结合到所述免疫球蛋白的所述半胱氨酸
残基,第二个活性位点结合到所述原子或分子。
15.权利要求14所述的免疫球蛋白结合物,其中所述连接分子选自腙、二硫化物、
肽、螯合剂和马来酰亚胺。
16.权利要求1-15中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述原子或分子选自
放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、
荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、
RNA模拟物和适配体。
17.权利要求1-15中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述原子或分子选自
90Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥
利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙
基淀粉和甘露糖基残基。
18.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述原子或分子降低
未突变免疫球蛋白的免疫原性。
19.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述原子或分子增加
未突变免疫球蛋白的免疫原性。
20.权利要求1-19中任一项所述的免疫球蛋白结合物,其中所述免疫球蛋白结合
物进一步包括抗原结合活性,所述活性是所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活性
的至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%。
21.修饰或分离的免疫球蛋白,其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、
125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)和326(CH2)残基处的至少一个突变,其中所
述至少一个突变是用半胱氨酸残基的置换。
22.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述至少一个突变是在选
自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。
23.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述至少一个突变是在选
自248(CH2)和326(CH2)的残基处。
24.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述至少一个突变是在选
自25(VH)和286(CH2)的残基处。
25.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述至少一个突变是在残
基254(CH2)处。
26.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述免疫球
蛋白选自包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
27.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述免疫球
蛋白包括IgG1。
28.权利要求21-27中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人CH1结
构域。
29.权利要求21-28中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人CH2结
构域。
30.权利要求21-29中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人CH3结
构域。
31.权利要求21-30中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人CL结构
域。
32.权利要求21-31中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人VH结构
域。
33.权利要求21-32中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其包括人VL结构
域。
34.权利要求21-33中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白,其中所述免疫球
蛋白进一步包括抗原结合活性,所述活性是所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活
性的至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%。
35.分离或重组的多核苷酸,其编码权利要求21-34中任一项所述的免疫球蛋白。
36.载体,其包括权利要求35所述的多核苷酸。
37.权利要求36所述的载体,其进一步包括可操作地连接到所述多核苷酸的可诱
导启动子。
38.宿主细胞,其包括权利要求36或权利要求37所述的载体。
39.生产免疫球蛋白的方法,其包括:
(a)提供包括权利要求38所述的宿主细胞的培养基;和
(b)将所述培养基置于所述免疫球蛋白被表达的条件下。
40.权利要求39所述的方法,进一步包括(c)分离所述免疫球蛋白。
41.产生免疫球蛋白结合物的方法,包括:
(a)提供权利要求21-34中任一项所述的免疫球蛋白;
(b)用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残
基;和
(c)用原子或分子温育所述免疫球蛋白,其中所述原子或分子与所述还原的
半胱氨酸残基反应,以形成免疫球蛋白结合物。
42.降低免疫球蛋白结合物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之
间交联的方法,包括:
(a)提供免疫球蛋白;
(b)用半胱氨酸残基置换选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基,
(c)用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残
基;
(c)用原子或分子温育所述免疫球蛋白,其中所述分子与所述还原的半胱氨
酸残基反应,以形成免疫球蛋白结合物;和
(d)产生免疫球蛋白结合物的高浓液体制剂,其中所述免疫球蛋白结合物浓
度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、
至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。
43.权利要求42所述的方法,其中所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和
IgG4。
44.权利要求42所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
45.权利要求42-44中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人CH1结构
域。
46.权利要求42-45中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人CH2结构
域。
47.权利要求42-46中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人CH3结构
域。
48.权利要求42-47中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人CL结构域。
49.权利要求42-48中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人VH结构域。
50.权利要求42-49中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白包括人VL结构域。
51.权利要求42-50中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员:N·陈纳姆塞蒂B·海尔克V·卡瑟尔B·垂奥特V·沃诺夫
申请(专利权)人:诺华公司麻省理工学院
类型:发明
国别省市:

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