用于为血液肿瘤提供离体个体化药物测试的方法技术

在此描述的是提供用于血液肿瘤个体化药物测试的方法、装置和组合物。在一些实施方案中，所述方法包括测量使用许多潜在的可供选择的联合药物治疗选择性地诱导恶性细胞凋亡的效力。在一些实施方案中，使用最近提取的患者血液样品测量离体测试。在其它实施方案中，使用自动流式细胞术平台离体测量所述效力。例如，通过利用自动流式细胞术平台，可以离体进行数百甚至数千种药物和组合物的评估。因而，可以研究可选择的多药疗法治疗。令人惊奇的是，非细胞毒性药物能选择性地诱导离体恶性细胞的凋亡。在一些实施方案中，在此描述的方法包括评估非细胞毒性药物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求于2009年5月19日提交的美国临时专利申请系列号61/179685的优先权，其通过引用全文并入本文。专利技术背景本专利技术涉及筛选平台在使用癌症患者标本来确定多种药物和药物组合的细胞毒性药物敏感性特征中的应用。在此描述了通过流式细胞术将自动样品制备和自动评估相结合的基于细胞的筛选平台，由于其快速的数据采集、分析和报告结果，甚至是在极其大量的药物和药物组合时，因此该筛选平台可用于个体化药物测试。还公开了可用于治疗增殖性淋巴疾病的特定药物组合。相关技术描述可利用许多方法评估从癌症患者取得的离体样品中肿瘤细胞的细胞毒性药物的敏感性特征。在过去的40年里，已开发了用于检测血液肿瘤中的细胞死亡的离体测定，导致产生很多用于鉴定化学敏感性的测定。最近提议将术语个体化肿瘤响应测试/测试(ITRT)用于这些方法来描述“抗癌治疗对从癌症患者新鲜分离的完整活肿瘤细胞的影响”(Bosanquetet al.，G.J.Kaspers，B.Coiffier，M.C.Heinrich和E.H.Estey.New York，NY，2008，Informa Healthcare：23-44)。最初设计用于研究药物减缓或阻止肿瘤细胞生长(例如克隆生成测定)能力的ITRT不起作用。然而，二十世纪八十年代中，开发了许多始终可显示测定结果和临床结果之间良好比较(即临床相关性)的细胞死亡的ITRT。即使具有良好的临床相关性，但目前可利用的细胞死亡的ITRT遭受限制其用作个体化药物测试的不期望的限制。例如，克隆生成测定通常需要几周而不是几天来产生结果，这限制了它们的临床用途(Hamburger etal.，Science 1911，197：461-463；Marie et al.，Br J Haematol 1983，55：427-437；Selby et al.，New Engl J Med 1983，308：129-134)。同样地，大部分ITRT测量总的细胞死亡来评估用药物孵育离体样本的作用。测量总的细胞死亡限制了ITRT区分药物对肿瘤细胞的影响和对正常细胞的影响之间的能力。目前可利用的ITRT彼此之间的区别主要是关于在测试结束时所使用的确定活细胞或活肿瘤细胞百分比的方法。虽然一些ITRT直接测量细胞，但是大多数ITRT使用替代标记物间接评估细胞死亡。例如，MTT(甲基噻唑基四唑)测定法通过测量线粒体将MTT还原成甲臜所引起的可以使用分光光度计进行定量的颜色变化来估计活细胞数量(Pieters et al.，Blood 1990，76：2327-2336；Sargent et al.，BrJ Cancer 1989，60：206-210；Carmichael et al.，Cancer Res 1987，47：936-942)。其它ITRT利用荧光素的二乙酸酯水解(例如，微培养细胞毒荧光分析(FMCA))或作为细胞活力间接标记物的细胞ATP水平(Rhedinet al.，Leuk Res 1993，17：271-276；Larsson et al.，Int J Cancer 1992，50：177-185)。DiSC(细胞毒性差异染色(Differential Staining cytotoxicity))试验和最近的TRAC(肿瘤对抗肿瘤化合物的响应)试验，利用染色法通过显微镜来确定活肿瘤细胞(Bosanquet et al.，Br J Haematol 2009，146：384-395；Bosanquet et al.，Leuk Res 1996，20：143-153；Weisenthal et al.，Cancer Res 1983，43：749-757)。上述ITRT需要将患者的肿瘤细胞与细胞毒性药物一起孵育至少4至5天的时间。然而，血液细胞在人体外仅24至48小时就开始失去重要的特性。较短的孵育时间将允许在患者治疗开始之前评估离体细胞毒性特征，从而增加它们的临床效用并允许作为个体化药物测试的更为有效的应用。已证实细胞毒性药物可通过诱导凋亡来消除恶性细胞(Aragane et al.，J Cell Biol 1998，140：171-182；Hannun et al.，Blood 1997，89：1845-1853)。凋亡是一类细胞死亡，通常在本领域内被称为“程序性细胞死亡”，其在领域内根据形态学和抗原性特征来定义。凋亡通常在药物与靶细胞接触的几小时内开始(Del Bino et al.，Cell Prolif 1999，32：25-37)。有许多基于反映凋亡过程不同方面的标记物的凋亡测定，如：1)利用DiOC6或JC-I改变线粒体膜电位(Tabrizi et al.，Leukemia 2002，16：1154-1159；Liu et al.，Leukemia 2002，16：223-232)；2)利用电泳或用吖啶橙标记(Tabrizi et al.，Leukemia 2002，16(6)：1154-9；Kim et al.，Exp Mol Med 2000，32：197-203；Konstantinov et al.，J Cancer Res Clin Oncol 2002，128：271-278；Ofir et al.，Cell Death Differ 2002，9：636-642)，通过末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)测定中的Tdt鉴别核小体间DNA的片段化(Liu et al.，Leukemia 2002，16：223-232)；或者3)利用特异性抗体，鉴别多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)或半胱氨酸蛋白酶-3的蛋白水解片段(Konstantinov et al.，J Cancer ResClin Oncol 2002，128(5)：271-8；Ofir et al.，Cell Death Differ 2002，9(6)：636-42；Byrd et al.，Blood 2002，99：1038-1043；et al.，Oncogene 2004，23：4523-4535；Prokop et al.，Oncogene 2003，22：9107-9120)。另一种凋亡测定是基于利用流式细胞术对与荧光标记物(即荧光染料)缀合缀合的Annexin V的检测。Annexin V与仅出现在经历凋亡的细胞的膜表面的表面化磷脂酰丝氨酸残基结合(Tabrizi et al.，Leukemia 2002，16(6)：1154-9；Nimmanapalli et 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.19 US 61/179,6851.用于分析细胞对药物响应性的方法，其包括：
从已离开患者的血液肿瘤获得组织样品；
将所述组织样品分成至少35份等分试样；
将所述至少35份等分试样各自与药物组合物结合；以及
测量所述至少35份等分试样每一份中的至少一种细胞群的凋亡。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述来自血液肿瘤的组织是选
自外周血、骨髓、淋巴结和脾的组织。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述样品为冷冻
或冷藏样品，并且其中在将所述样品分成至少35份等分试样之前，将
所述冷冻或冷藏样品解冻。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述测量在将所
述等分试样与药物组合物结合72小时以内完成。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述测量在将所
述等分试样与药物组合物结合48小时以内完成。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述测量在将所
述等分试样与药物组合物结合24小时以内完成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述测量使用流
式细胞仪进行。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述具有独特药
物组合物的等分试样的数量为至少约96份。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中至少两种药物组
合物包含不同浓度的相同药物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中至少一种药物
组合物包含多种药物。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中至少一种药物
组合物包含多种非细胞毒性药物。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中至少一种药物
组合物包含与已经给予患者的药物相同的或处于相同治疗类别中的非
细胞毒性药物。
13.如权利要求12所述的方法，其中至少一种药物组合物结合有
非细胞毒性药物与细胞毒性药物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中选择性测量特
定细胞群的凋亡。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中测量指征血液
肿瘤的细胞群的凋亡。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述血液肿瘤选自：慢性淋
巴细胞白血病、成人急性淋巴细胞白血病、小儿急性淋巴细胞白血病、
多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非M3型急性髓细胞白血病、
M3型急性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性髓
性白血病。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中至少一种药物
组合物包含氟达拉宾或苯丁酸氮芥与舍曲林、帕罗西汀或氟西汀的组
合。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中至少一种药物
组合物包含氟达拉宾和环磷酰胺。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括：
将来自血液肿瘤组织样品的细胞注射给小鼠；
允许所述注射的细胞在小鼠内增殖足够的时间；以及
从小鼠内移出所述增殖的细胞，其中所述注射、增殖和移出在将
所述等分试样与药物组合物结合之前进行。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括：
准备总结所述测量步骤结果的报告。
21.如权利要求20所述的方法，其还包括：
将所述报告提供给患者医疗护理的参与方。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述药物组合
物包含选自以下的化合物：5-氮杂胞苷、阿仑单抗、氨喋呤、氨萘非
特、安吖啶、CAT-8015、贝伐单抗、ARR Y520、三氧化二砷、AS1413、
全反式维甲酸、AZD 6244、AZD1152、巴诺蒽醌、依诺他宾、苯达莫
司汀、博莱霉素、兰妥莫单抗、硼替佐米、白消安、卡铂、CEP-701、
苯丁酸氮芥、氯脱氧腺苷、克拉屈滨、克罗拉滨、CPX-351、环磷酰
胺、环孢素、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、达沙替尼、柔红霉素、
地西他滨、去糖基化-蓖麻蛋白-A链-缀合的抗-CD19/抗-CD22免疫毒
素、地塞米松、多柔比星、艾西拉滨、恩替诺特、依帕珠单抗、Erwinase、
依托泊甙、依维莫司、甲磺酸依沙替康、夫拉平度、氟达拉宾、
forodesine、吉西他滨、吉妥单抗-奥唑米星、高三尖杉酯碱、氢化可
的松、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α-2a、碘
I 131单克隆抗体BC8、异环磷酰胺、异维甲酸、拉莫司汀、L-门冬酰
胺酶、来那度胺、来他替尼、马磷酰胺、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋
呤、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松、米哚妥林、米托蒽醌、奈拉滨、尼
罗替尼、奥利默森、紫杉醇、帕比司他、培门冬酶、喷妥司汀、吡柔
比星、PKC412、泼尼松龙、泼尼松、PSC-833、雷帕霉素、利妥昔单
抗、利巴韦林、沙帕他滨、Dinaciclib、索拉非尼、索拉非尼、STA-9090、
他克莫司、坦螺旋霉素、西罗莫司脂化物、替尼泊甙、特拉罗考、沙
利度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替吡法尼、拓扑替康、曲丁磺酯、曲沙
他滨、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏利拉辛、伏立
诺他、依托泊甙、唑喹达以及以上的组合。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述药物组合
物包含选自以下的化合物：水合氧化铝、劳拉西泮、阿米卡星、美罗
培南、头孢吡肟、万古霉素、替考拉宁、恩丹西酮、地塞米松、两性
霉素B(脂质体)、卡泊芬净、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、甲氧苄
啶、磺胺甲噁唑、G-CSF、雷尼替丁、拉布立酶、对乙酰氨基酚、安
乃近、氢氯酸吗啡、奥美拉唑、帕罗西汀、氟西汀、舍曲林以及以上
的组合。
24.用于分析肿瘤细胞对药物响应的方法，其包括：
从患者采集的血液肿瘤获得组织样品；
将所述组织样品分成至少35份等分试样；
将所述至少35份等分试样与药物组合物结合，其中每一等分试样
中的药物组合物与所有其它等分试样中的药物组合物在药物特性、浓
度或它们的组合中的至少一种有所不同，并且其中所述药物组合物均
包含至少一种非细胞毒性药物；
孵育与药物组合物结合的等分试样；以及
对于每一孵育的等分试样，分析至少一种类型的肿瘤细胞对所述
药物组合物的响应性。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述组织选自外周血、骨髓、
淋巴结和脾。
26.如权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述样品为
冷冻或冷藏样品，并且其中在将所述样品分成至少35份等分试样之前，
将所述冷冻或冷藏样品解冻。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述分析在
将所述等分试样与药物组合物结合72小时以内完成。
28.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述分析在
将所述等分试样与药物组合物结合48小时以内完成。
29.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述分析在
将所述等分试样与药物组合物结合24小时以内完成。
30.如权利要求24至29中任一项所述的方法，其还包括：
准备总结所述分析步骤结果的报告。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括：
将所述报告提供给患者医疗护理的参与方。
32.如权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述与药物
组合物结合的等分试样的数量为至少约96份。
33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述测量使
用流式细胞仪进行。
34.如权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细
胞是血液肿瘤的指征。
35.如权利要求34所述的方法，其中血液肿瘤选自：慢性淋巴细
胞白血病、成人急性淋巴细胞白血病、小儿急性淋巴细胞白血病、多
发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非M3型急性髓细胞白血病、M3
型急性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性髓性白
血病。
36.如权利要求24至35中任一项所述的方法，其还包括：
将来自组织样品的肿瘤细胞注射给小鼠；
允许所述注射的肿瘤细胞在小鼠内增殖足够的时间；以及
从小鼠内移出所述增殖的肿瘤细胞，其中所述注射、增殖和移出
在将所述等分试样与药物组合物结合之前进行。
37.如权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述药物组
合物包含选自以下的化合物：5-氮杂胞苷、阿仑单抗、氨喋呤、氨萘
非特、安吖啶、CAT-8015、贝伐单抗、ARR Y520、三氧化二砷、AS1413、
全反式维甲酸、AZD 6244、AZD1152、巴诺蒽醌、依诺他宾、苯达莫
司汀、博莱霉素、兰妥莫单抗、硼替佐米、白消安、卡铂、CEP-701、
苯丁酸氮芥、氯脱氧腺苷、克拉屈滨、克罗拉滨、CPX-351、环磷酰
胺、环孢素、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、达沙替尼、柔红霉素、
地西他滨、去糖基化-蓖麻蛋白-A链-缀合的抗-CD19/抗-CD22免疫毒
素、地塞米松、多柔比星、艾西拉滨、恩替诺特、依帕珠单抗、Erwinase、
依托泊甙、依维莫司、甲磺酸依沙替康、夫拉平度、氟达拉宾、
forodesine、吉西他滨、吉妥单抗-奥唑米星、高三尖杉酯碱、氢化可
的松、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α-2a、碘
I 131单克隆抗体BC8、异环磷酰胺、异维甲酸、拉莫司汀、L-门冬酰
胺酶、来那度胺、来他替尼、马磷酰胺、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋
呤、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松、米哚妥林、米托蒽醌、奈拉滨、尼
罗替尼、奥利默森、紫杉醇、帕比司他、培门冬酶、喷妥司汀、吡柔
比星、PKC412、泼尼松龙、泼尼松、PSC-833、雷帕霉素、利妥昔单
抗、利巴韦林、沙帕他滨、Dinaciclib、索拉非尼...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡安·巴勒斯特若斯，特里萨·班尼特，丹尼尔·普瑞莫，艾伯特·奥夫奥，考伊特·杰克逊，圣地亚哥·莱格，玛利亚·马特塞斯，莉莉亚·苏莱兹，桑德拉·萨皮亚，安德鲁·博桑基特，朱利安·高若查特奎，康斯埃洛·图德拉，佩勒·荷南德兹，刘易斯·艾格纳西欧·卡威达，
申请(专利权)人：维维雅生物技术公司，
类型：发明
国别省市：