一种检测安定(DIA)的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对肉类、鱼类等动物性食品及饲料中DIA含量的检测。本发明专利技术配制的试剂盒，采用TRFIA检测DIA，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有DIA-OVA，加入DIA标准或样品，再加入DIA抗体。游离的DIA与微孔板上的DIA-OVA竞争DIA抗体，没有连接的DIA抗体被洗涤除去，加入Eu3+-羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的DIA浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中DIA的含量。本发明专利技术提供的检测DIA试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
一种检测安定(CPZ)的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
，用于对尿液、组织、饲料等样品中安定的含量检测。
技术介绍
安定又名地西泮(diazepam)，是临床常用的镇静、催眠药物。长期服用该类药物可产生依赖性或成瘾性。近几年来，有些饲料企业为了追求饲料的转化率和高额利润，在饲料中安定，安定经肝脏代谢为奥沙西泮，仍有生物活性，故连续应用可蓄积。为此国家有关部门下文将安定类明确定为禁止添加的药物之一。目前，检测安定较为常用的方法有：高效液相色谱法(HPLC)，薄层扫描法(TLC)，光化学荧光分析法(PCFA)，酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中免疫测定法由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。TRFIA是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement Solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测DIA的试剂盒及其检测方法，用于对尿液、组织、饲料等样品中安定含量的检测。本专利技术中要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测DIA。技术方案：该检测DIA的试剂盒是由(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)安定标准，(4)安定的抗体冻干品，(5)铕标记的羊抗兔抗体，(6)洗涤液，(7)增强液所组成。本专利技术测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有DIA-OVA的微孔板，加入DIA标准或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入DIA抗体，振荡反应，游离的DIA与微孔板上的DIA-OVA竞争DIA抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DIA抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的EU3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。附图说明图1：DIA-TRFIA反应示意图。图2：DIA-TRFIA标准曲线图。图3：检测安定的试剂盒示意图。(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)安定标准，(4)安定的抗体冻干品，(5)铕标记的羊抗兔抗体，(6)洗涤液，(7)增强液。具体实施方案实施例1按下列步骤制备试剂盒和检测尿液样品：(1)Eu3+-羊抗兔抗体的制备：取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2m，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。(2)包被板固相抗原制备：将DIA-OVA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9.6缓冲液稀释至5mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗两次，加150μ1含3g/LBSA的上述缓冲液封闭.4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。(3)试剂的配制：A.标准安定(DIA)：(0ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml)，从DIA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3。B.缓冲液：8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3的Tris-HCl pH7.8。C.洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/LTween-80和0.2％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。D.增强液的配制：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟内酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1ml曲拉通X-100(Triton X-100)。(4)试剂盒提供的试剂：每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：A.1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有DIA-OVA。B.6×DIA标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为：0ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml。C.1×DIA抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。D.1×EU3+-羊抗兔抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。E.1×增强液：15ml。F.1×洗涤液：30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释。G.1×缓冲液：30ml。(5)测定之前注意事项：A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。B.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。C.如果样品量大建议使用多通道移液器。D.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。E.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。(6)具体检测步骤如下：取DIA-OVA板条，加入50μl的DIA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的DIA抗体50μl，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1∶20稀释的Eu3+-羊抗兔抗体100μl，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测安定(DIA)的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由(1)96或48孔包被板(2)缓
冲液(3)安定标准(4)安定的抗体冻干品(5)铕标记的羊抗兔抗体(6)洗涤液(7)增强液所组成。
2.一种用权利要求1所述的试剂盒安定的方法，其特征是取包被有DIA-OVA的微孔包被板，加入DIA
标准或处现好的样品到各自的微孔中，再加入DIA抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔
抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度c...
【专利技术属性】
技术研发人员：岳振峰，匡燕云，范放，赵芳，黄飚，张建莹，赵凤娟，朱海，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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