一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒制造技术

本发明专利技术提出了一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。本发明专利技术的试剂盒包括针对GJB2(Cx26)基因、SLC26A4(PDS)基因和12S?rRNA(MTRNR1)基因上的八个遗传性耳聋的基因位点的引物组合物和探针组合物，可用于准确判断相关位点为野生型、纯合突变型或者杂合突变型，以实现遗传性耳聋分子诊断。该引物组合物包含一些经发光体标记的引物。应用本发明专利技术的试剂盒可以通过荧光显微镜、微阵列激光扫描仪、价廉的设备或者肉眼观察进行检测。本发明专利技术提供的引物组、试剂组以及试剂盒可以用于遗传性耳聋的临床辅助诊断及筛查，实现遗传性耳聋的早期发现、提早预防以及产前指导，具有重大的商业价值和社会意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测相关领域，涉及一种检测遗传性耳聋的试剂盒，特别涉及一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。
技术介绍
遗传性耳聋是通过遗传由父母传给其子女。不论父母方中的单方或者双方是耳聋患者还是健康携带者，耳聋基因都会通过父母向子女遗传。这种疾病通过常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁隐性，或者线粒体遗传等方式遗传给下一代。大约0.1％的孩子生来具有深度耳聋，超过50％的语前耳聋患儿属于遗传因素致聋，通过对基因突变的识别不仅可用于遗传咨询、产前诊断和新生儿听力筛查，还可以帮助和提醒医生慎重使用特定种类的抗生素以避免造成携带基因突变的患者听力损伤甚至致聋。近几年微阵列芯片技术的发展使得高通量地并行分析成千上万的分子相互作用成为可能。DNA微阵列芯片方法已被广泛使用，包括基因表达分析、突变分型、单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复序列(STR)，对药物开发、疾病诊断和司法鉴定起到重要作用(Heller，Ann Rev Biomed Eng(2002)4：129-153；Stoughton，Ann Rev Biochem(2005)74：53-82；Hoheisel，Nat Rev Genet(2006)7：200-210)。固定于微阵列芯片的特定核苷酸探针，充当解码工具，通过空间上不同的位置把溶液中并行反应产生的多个靶标分子加以区别(Zhu et al.，Antimicrob Agents Chemother(2007)51：3707-3713)。这些探针甚至可以是通用探针，比如通用芯片上经过设计与人工合成的人造标签(Tag)序列或者相互补的序列(Gerrey et al.，J Mol Biol(1999)292：251-262；Li et al.，Hum Mutat(2008)29：306-314)。微阵列芯片方法与多重PCR结合在一起，可用于检测SNP与基因突变，包括碱基删除、插入、以及长片段缺失，适用于常规的遗传和诊断实验室开展。与此同时，蛋白芯片和化学芯片也已经发展成为蛋白质组学领域两个重要的工具(Xu and Lam，J Biomed Biotechnol(2003)5：257-266)。特定的蛋白质、抗体、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固体表面形成微阵列芯片，类似于DNA微阵列芯片。这些分子的微阵列芯片可以用于分析单一的分子组成或者复杂的分子组成。待检样本和固定在微阵列芯片表面的探针之间的相互作用可以通过多种方法加以检测。通常情况下，微阵列芯片的检测方法有基于荧光、化学发光或酶连标记的光学检测方法，基于酶标记、二茂铁标记或其他电活性标记的电化学检测方法，以及基于表面等离子共振技术或微天平分析技术的无标记的检测方法(Sassolas et al.，Chem Rev(2008)108：109-139)。当然，磁珠标记方法也被采用，其结果可以用基于电荷耦合器件(CCD)的相机、摄像机或低倍显微镜进行成像分析(Guo et al.，J Anal Sci (2007)23：1-4；Li et al.，supra；Shlyapnikov et al.，Anal Biochem(2010)399：125-131)，而且交叉反应和非特异性吸附能通过磁场或流体来快速地加以消除(Mulvaney et al.，Anal Biochem(2009)392：139-144)。理论上，上述发光方法与磁珠方法是可以进一步结合的，即将两者的优点进行组合，应该能提高芯片检测平台的灵敏度和特异性，这对基因突变检测尤其临床相关的检测非常有意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。本专利技术提供了辅助检测遗传性耳聋的引物组I，为如下(a)或(b)：(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。所述引物组I的(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组I的(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸可标记有荧光素Cy3。本专利技术提供了辅助检测遗传性耳聋的试剂I，由所述引物组I和探针组I组成；所述探针组I为如下(a)或(b)或(c)：(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA；(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。本专利技术提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组II，为如下(a)或(b)：(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5’末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA。所述引物组II的(a)或(b)中，序列表的序列26所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组II的(a)或(b)中，所述序列表的序列26所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可标记有荧光素Cy3。本专利技术提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂II，由所述引物组II和探针组II组成；所述探针组II为如下(a)或(b)或(c)：(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA；(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.辅助检测遗传性耳聋的试剂盒，为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)：
(1)所述试剂盒包括引物组合物；所述引物组合物由权利要求6所述的引物组I、
权利要求9所述的引物组II、权利要求12所述的引物组III、权利要求15所述的引物
组IV、权利要求18所述的引物组V、权利要求21所述的引物组VI、权利要求24所述
的引物组VII和权利要求27所述的引物组VIII组成；
(2)所述试剂盒包括引物组合物；所述引物组合物由权利要求7所述的引物组I、
权利要求10所述的引物组II、权利要求13所述的引物组III、权利要求16所述的引物
组IV、权利要求19所述的引物组V、权利要求22所述的引物组VI、权利要求25所述
的引物组VII和权利要求28所述的引物组VIII组成；
(3)所述试剂盒包括试剂组合物；所述试剂组合物由权利要求8所述的试剂I、
权利要求11所述的试剂II、权利要求14所述的试剂III、权利要求17所述的试剂IV、
权利要求20所述的试剂V、权利要求23所述的试剂VI、权利要求26所述的试剂VII和
权利要求29所述的试剂VIII组成；
(4)所述试剂盒包括引物组合物；所述引物组合物由如下组分中的一种或几种组
成：权利要求6或7所述的引物组I、权利要求9或10所述的引物组II、权利要求
12或13所述的引物组III、权利要求15或16所述的引物组IV、权利要求18或19所
述的引物组V、权利要求21或22所述的引物组VI、权利要求24或25所述的引物组
VII和权利要求27或28所述的引物组VIII；
(5)所述试剂盒包括试剂组合物；所述试剂组合物由如下组分中的一种或几种组
成：权利要求8所述的试剂I、权利要求11所述的试剂II、权利要求14所述的试剂
III、权利要求17所述的试剂IV、权利要求20所述的试剂V、权利要求23所述的试剂
VI、权利要求26所述的试剂VII和权利要求29所述的试剂VIII。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括基片、所述试剂组
合物和颗粒；所述试剂组合物中的探针组固定于所述基片上，形成微阵列芯片；所述
基片的材质为硅、玻璃、塑料、水凝胶、硝酸纤维或尼龙；所述颗粒为微球或磁性微
球。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述微阵列芯片上还排列有阳性对
照MC、阳性对照PC、阴性对照NC和阳性对照QC；所述阳性对照MC为序列表的序列
17所示的DNA或在序列表的序列17所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA；所
述阳性对照PC为序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5’末
端连接所述特异片段得到的DNA；所述阴性对照NC为序列表的序列19所示的DNA或

\t在序列表的序列19所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述阳性对照
QC为序列表的序列20所示的DNA或在序列表的序列20所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’
末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的
DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括序列表的序列
46所示的DNA和如下DNA(A)或(B)：
(A)序列表的序列45自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA；
(B)序列表的序列45所示的DNA。
5.如权利要求2至5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述颗粒为链霉亲和素
包被的颗粒；序列表的序列46所示DNA的5’末端连接有生物素，自5’末端第8位
核苷酸标记有荧光素Cy3；序列表的序列17所示DNA的3’末端连接有生物素；序列
表的序列20所示DNA的3’末端连接荧光素HEX。
6.辅助检测遗传性耳聋的引物组I，为如下(a)或(b)：
(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21自5’末端
第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5’末端第23至41位核苷酸所
示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；
(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21所示的DNA、
序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。
7.如权利要求6所述的引物组I，其特征在于：所述(a)或(b)中，序列表的
序列23所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列
23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3。
8.辅助检测遗传性耳聋的试剂I，由权利要求6或7所述引物组I和探针组I组
成；所述探针组I为如下(a)或(b)或(c)：
(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列1所示DNA和序
列表的序列2所示DNA；
(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为
15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；
(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’

\t末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的
DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。
9.辅助检测遗传性耳聋的引物组II，为如下(a)或(b)：
(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24自5’末端
第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5’末端第23至40位核苷酸所
示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；
(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24所示的DNA、
序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA。
10.如权利要求9所述的引物组II，其特征在于：所述(a)或(b)中，序列表
的序列26所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序
列26所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3。
11.辅助检测遗传性耳聋的试剂II，由权利要求9或10所述引物组II和探针组II
组成；所述探针组II为如下(a)或(b)或(c)：
(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列3所示DNA和序
列表的序列4所示DNA；
(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为
15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；
(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’
末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的
DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。
12.辅助检测遗传性耳聋的引物组III，为如下(a)或(b)：
(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27自5’末端
第25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列28自5’末端第24至40位核苷酸所
示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；
(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27所示的DNA、
序列表的序列28所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA。
13.如权利要求12所述的引物组III，其特征在于：所述(a)或(b)中，序列表
的序列29所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序
列29所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3。
14.辅助检测遗传性耳聋的试剂III，由权利要求12或13所述引物组III和探针组
III组成；所述探针组III为如下(a)或(b)或(c)：
(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列5所示DNA和序
列表的序列6所示DNA；
(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为
15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；
(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA
的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述
特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’
末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的
DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。
15.辅助检测遗传性...

【专利技术属性】
技术研发人员：高华方，项光新，蒋迪，邢婉丽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：