麻疹-疟疾联合疫苗制造技术

本发明专利技术涉及含有不同的减毒重组麻疹-疟疾载体的麻疹-疟疾联合疫苗，所述载体包含编码几种恶性疟原虫(Plasmodium?falciparum)抗原的异源核酸。优选地，其涉及包含核酸的病毒载体，所述核酸编码恶性疟原虫的环子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白、恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白1(merozoite?surface?protein?1，MSP-1)及其糖基化和分泌形式的衍生物(p-42；p-83-30-38)和锚定或分泌形式的恶性疟原虫的顶膜抗原1(apical?membrane?antigen?1，AMA1)。所述病毒载体源自减毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效地递送目的基因还有效地结合并感染相关免疫细胞的毒株。在一个优选的实施方案中，CS、MSP1和AMA1蛋白从病毒中产生，从而使它们在哺乳动物(优选人)中引发强免疫应答；所述蛋白的表达因为人密码子优化而升高。另外，本发明专利技术涉及所述重组疫苗在疟疾的预防性治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及含有不同的减毒重组麻疹-疟疾载体的麻疹-疟疾联合疫苗，所述载体包含编码几种恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗原的异源核酸。优选地，其涉及包含核酸的病毒载体，所述核酸编码恶性疟原虫的环子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白、恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1，MSP-1)及其糖基化和分泌形式的衍生物(p-42；p-83-30-38)和锚定或分泌形式的恶性疟原虫的顶膜抗原1(apical membrane antigen 1，AMA1)。所述病毒载体源自减毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效地递送目的基因还有效地结合并感染相关免疫细胞的毒株。在一个优选的实施方案中，CS、MSP1和AMA1蛋白从病毒中产生，从而使它们在哺乳动物(优选人)中引发强免疫应答；所述蛋白的表达因为人密码子优化而升高。另外，本专利技术涉及所述重组疫苗在疟疾的预防性治疗中的用途。背景信息麻疹病毒本专利技术涉及含有重组减毒麻疹病毒(表达恶性疟原虫(Pf)的抗原)的疫苗及其用于制备重组的麻疹-疟疾疫苗的用途，所疫苗赋予针对麻疹和疟疾抗原两者的免疫力。麻疹病毒(MV)是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)的成员，即具有非区段负链RNA基因组的病毒。MV的非区段基因组具有反信使极性(antimessage polarity)；因此，所述基因组RNA不在体内或体外翻译。另外，只有在当其以核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物(见下文)的形式非常特异地与三种病毒蛋白相结合时才有生物学活性。非区段(-)链RNA病毒的转录和复制及其病毒颗粒的组装已被详细地综述(1)。麻疹病毒的转录和复制不涉及所感染细胞的核，而是发生在所感染细胞的胞质中。麻疹病毒基因组包含编码来自六个基因(命名为N、P、M、F、H和L)的六个主要结构蛋白以及来自P基因的另外两个非结构蛋白C和V(涉及对抗基本免疫应答和转录/复制的调节)的基因。基因顺序是3′N、P(包括C和V)、M、F、H和L 5′。此外，从3′-末端区转大约50个核苷酸的短前导RNA。所述基因分别编码病毒的核壳体(ribonucleocapsid，RNP)蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大聚合酶/复制酶蛋白(L)，它们非常紧密地与基因组RNA结合，形成RNP。编码病毒衣壳蛋白的其他基因包括血凝素(H)、融合蛋白(F)和基质蛋白(M)。MV基因的转录遵循递减的梯度：当聚合酶在基因组模板上操作时，与从下游基因相比其从上游基因合成更多的RNA。在该不连续的转录模式下，mRNA被加帽和聚腺苷化。相反，在复制模式中，L蛋白产生全长的反基因组和基因组RNA，其立即被N、P和L蛋白覆盖以形成感染性子代RNP。麻疹病毒已于1954年分离：Enders和Peebles用David Edmoston(感染麻疹的儿童)的血接种原代人肾细胞，且所得的MV Edmoston毒株(2)随后适于在多种细胞系中生长。对鸡胚、鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast，CEF)和/或犬肾细胞和人二倍体细胞的适应产生了减毒的Edmonston A和B(3)、Zagreb(EZ)和AIK-C种。1963年，EdmonstonB被批准为第一个MV疫苗。Edmonston A和B在CEF中进一步传代产生了更为减毒的Schwarz和Moraten病毒(3)，最近证明它们的序列相同(4，5)。因为Edmonston B疫苗是反应原性的，其于1975年被放弃，并被Schwarz/Moraten疫苗所替代。也使用几种其他疫苗毒株：日本的AIK-C、Schwarz F88、CAM70、TD97，俄罗斯的Leningrad-16，还有Edmonston Zagreb。CAM70和TD97中国毒株并不是来自Edmonston。Schwarz/Moraten和AIK-C疫苗是在CEF中生产的。Zagreb疫苗是在人二倍体细胞(WI-38)中生产的。如今，通常使用Schwarz/Moraten、AIK-C和EZ疫苗(6)，但原则上说，这些减毒疫苗毒株的任何一种都是同一种被证明安全并且诱导长期的免疫应答的独特MV血清型，它们可用于本专利技术的目的。单次或两次低剂量注射之后，MV疫苗诱导终生免疫力。针对麻疹的保护通过抗体以及CD4和CD8T细胞介导。已证明接种后MV特异性抗体和CD8细胞维持长达25年(7)。在大多数国家，MV疫苗易于大规模生产，并可低成本地分发。因为MV基因组的减毒来自多种突变的优势组合，所以该疫苗非常稳定并且从未观察到致病性的恢复(6)。对于安全性，MV仅在细胞质中复制，排除了整合进入宿主DNA的可能性。这些特性使得活减毒MV疫苗成为用作多价接种载体的有吸引力候选。这样的疫苗可被证明针对其他病原物质与针对载体病毒本身一样有效引发长期免疫保护。Martin Billeter及同事克隆了对应于Edmonston MV的反基因组的cDNA，并建立了独创和高效的反向遗传学方法来拯救所述病毒(8)，如国际专利申请WO 97/06270中所述。从稳定转染并表达MV的N和P蛋白以及噬菌体T7RNA聚合酶的辅助细胞系293-3-46中回收重组麻疹病毒。为了拯救任何变体或重组MV，随后用编码L蛋白的表达质粒瞬时转染辅助细胞系，且最重要的是与任何反基因组质粒一起转染，该反基因组质粒被适合地构建以获得适于产生子代MV的任何突变的或重组的反基因组RNA。所述瞬时转染的步骤首先引起转录，优选通过所具有的T7RNA聚合酶引起。所产生的反基因组RNA立即(在新生状态中)被病毒N、P和L蛋白覆盖，以获得反基因组RNP，从中生产基因组RNP。随后，基因组RNP由所附的L所转录，产生全部病毒mRNA及其相应的蛋白质。最后，通过复制扩增基因组和反基因组RNP。在对本方法稍加变化的方法中，不使用稳定转染的293-3-46辅助细胞，而是瞬时转染市售的293T细胞，同时使用原专利说明中详述的全部5种质粒，它们编码N、P和T7聚合酶(以前用于产生辅助细胞系)，以及编码L的质粒和反基因组质粒。注意在“完全瞬时转染”方法中，还可以使用变体表达质粒并且为避免共同使用T7RNA聚合酶，而是使用已具有的RNA聚合酶II来表达L蛋白和反基因组(9)。为拯救单个的重组MV，所使用的反基因组质粒包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.05 IN 1181/MUM/20091.一种包含表达疟疾抗原之重组麻疹疫苗病毒的麻疹-疟疾联合疫
苗，其能引发针对麻疹和疟疾两者的免疫应答和保护。
2.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达单个的或不同的疟疾抗原。
3.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达MSP1疟疾抗原。
4.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中MSP1疟疾抗原为190至
200KDa(d190)。
5.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中MSP1疟疾抗原为
d83-30-38。
6.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中MSP1疟疾抗原为d42。
7.前述权利要求中任一项的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹
疫苗病毒表达锚定形式和分泌形式的MSP1疟疾抗原。
8.前述权利要求中任一项的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹
疫苗病毒表达3D7毒株和MAD 20优选FCB1毒株的锚定形式和分泌形
式的MSP1疟疾抗原。
9.前述权利要求中任一项的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹
疫苗病毒表达FCB1毒株的锚定形式和分泌形式的MSP1疟疾抗原。
10.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达多样性覆盖(DiCo)AMA1疟疾抗原。
11.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达AMA1疟疾抗原的DiCo-1。
12.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达AMA1疟疾抗原的DiCo-2。
13.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达AMA1疟疾抗原的DiCo-3。
14.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达AMA1疟疾抗原的DiCo-1、DiCo-2和DiCo-3。
15.权利要求10至14的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗
病毒表达跨膜形式和分泌形式的多样性覆盖(DiCo)AMA1疟疾抗原。
16.权利要求1的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表
达CS疟疾抗原。
17.前述权利要求中任一项的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述疟疾抗原
被克隆在重组麻疹疫苗病毒的P和M蛋白之间或H和L蛋白之间。
18.一种麻疹疫苗病毒载体，其包含疟疾抗原的核苷酸序列。
19.权利要求18的载体，其中所述核苷酸序列选自图26至图35。
20.权利要求18和19的载体，其中所述麻疹疫苗病毒载体还包含选
自图24至图25的核苷酸序列。
21.权利要求18的载体，其中所述核苷酸序列编码疟疾抗原，所述
抗原选自MSP1的d83-30-38和d42和d190片段或者多样性覆盖(DiCo)
AMA1或CS蛋白。
22.一种宿主，其包含权利要求18的载体。
23.权利要求22的宿主，其选自大肠杆菌或哺乳动物细胞系。
24.前述权利要求中任一项的麻疹-疟疾联合疫苗，其中所述重组麻疹
病毒源于衍生自Edmoston Zagreb的疫苗株。
25.前述权利要求中任一项的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖因哈德·格吕克，阿加塔·法齐奥，维维安娜·贾尼诺，马丁·比耶泰，
申请(专利权)人：卡迪拉保健有限公司，
类型：发明
国别省市：