A组轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿严重腹泻的最常见病原，在世界范围内流行，全球无论发达国家或发展中国家约90％的婴幼儿在3岁前都要受HRV感染。由于目前全世界流行的人轮状病毒株主要是G1、G2、G3和G9血清型。G5型轮状病毒最初是从猪的排泄物中分离到，随后在巴西、阿根廷等地检出。因此，这株G5轮状病毒的进一步进化是否非更适合感染人，成为人轮状病毒优势株，尤其是在轮状病毒疫苗大规模接种后，轮状病毒流行规律是否会发生改变。通过RT-PCR技术获得了该病毒的全序列。使用MA104细胞培养该病毒，获得了该病毒致细胞病变的电镜图片，使用半对数稀释法测定病毒半对数稀释法测定病毒滴度。
【技术实现步骤摘要】
本专利
属于生物技术应用领域。本专利技术是通过分子流行病学研究发现，罕见轮状病毒型别，基于MA104细胞培养，电镜和测序技术来确定人轮状病毒G5型的全基因序列，细胞病变特征及细胞滴度等。用于轮状病毒流行特征研究，以及暴发疫情的处理，为轮状病毒在我国大规模应用后，轮状病毒流行规律的提供基线参考。
技术介绍
A组轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿严重腹泻的最常见病原，在世界范围内流行，全球无论发达国家或发展中国家约90%的婴幼儿在3岁前都要受HRV感染。HRV在5岁以下儿童腹泻住院病例中占20-70%，每年造成约40-60万死亡病儿。由于目前全世界流行的人轮状病毒株主要是G1、G2、G3和G9血清型(合计高于85%，我国也如此)。自1983年美国首次报道了 G9型人轮状病毒以来，G9型人轮状病毒已经成为一些国家和地区的优势流行株。G5型轮状病毒最初是从猪的排泄物中分离到，随后在巴西、阿根廷、巴拉圭等地检出。 据分析，LL36755株G5型轮状病毒的VP7氨基酸序列与猪的G5血清型轮状病毒同源性较高。因此，LL36755株轮状病毒可能是猪轮状病毒G5型与人类毒株的重配株。轮状病毒是分阶段的RNA病毒，共有11个节段，一个片段编码一种蛋白；在自然条件或实验室条件下， 在复制时可能发生重配。VP6片段(第六基因)是决定病毒组或亚组的抗原蛋白，vp4(第 4基因)和vp7(第7，8或9基因，不同毒株，视不同毒株而定)是两个主要的诱导中和抗体的外壳结构蛋白(表面抗原)，决定病毒的血清型。轮状病毒血清型分为G型和P型，VP7 血清型为G型，vp4为P血清型。一般认为G是主要中核抗原，P是次要中和抗原。猪是最常见的家养牲畜，与人的接触非常密切。因此，这株G5轮状病毒的进一步进化是否非更适合感染人，成为人轮状病毒优势株，尤其是在轮状病毒疫苗大规模接种后， 轮状病毒流行规律是否会发生改变，因此对于这株G5病毒的进一步研究很有必要。
技术实现思路
1.通过本实验室的常规监测，发现了一株罕见轮状病毒G5血清型轮状病毒，经分析，该株轮状病毒可能为人轮状病毒和猪G5血清型轮状病毒自然感染状态下发生重配产生的新型轮状病毒。通过MA104进行细胞培养，并研究了病毒对细胞形态学的改变；并且测定了病毒的相应滴度。2.通过RT-PCR和race技术获得了这几株病毒的全基因序列。3.使用半对数稀释法测得病毒感染MA104细胞的滴度为1 16 附图说明图1轮状病毒G5血清型致MA104细胞病变 The CPE of MA104 caused by rotavirus G5图1是细胞的电镜图，其中A为MA104正常细胞形态，B为轮状病毒感染后MA104 细胞病变形态。3具体实施方案实施方案1.分子流行病学监测，选择我国流行优势轮状病毒型别。通过轮状病毒的通用引物和分型引物对本实验室的腹泻粪便标本进行筛查，通过统计学分析后，获得了相关的分子流行病学结果，G5型轮状病毒在我国属于罕见流行株，属于新检测出的轮状病毒。实施方案2.经过生物信息学分析，通过系统进化树分析，认为可能是来源与猪的G5型轮状病毒和人轮状病毒重配后产生。实施方案3.将粪便标本使用PBS处理后，通过0. 22um的滤器后，使用10ug/ml的胰酶处理在 37°处理30分钟，每瓶接种lOOul。37°C 5% C02静止培养1小时后弃毒液，每瓶加入含有 l-2ug/ml的胰酶处理的无血清MEM培养，观察细胞病变情况。在电镜下观察细胞病变情况， 细胞园缩，包内颗粒增加。病变达到75时，将感染细胞在-25°C冰箱内冻融两次后收获病实施方案4.终末释法测得了病毒感染MA104细胞的病毒滴度。将病毒感染液用MEM液进行稀释后(2-3，2-4···)，接种MA-104细胞96孔板进行末端稀释法分离，接种方法见实施方案2。 每个稀释度接种8孔，每孔接种IOOul，在实施方案2中的条件下进行培养，培养4天后观察细胞病变情况，判定是否用病变。按照Reed-Muench法判定TCID50的终点，将低于50%阳性的稀释度的阳性孔逐孔转移到M孔细胞培养板中培养扩增，收获病毒液。实施方案5.RACE技术获得了 G1、G2、G3和G9血清型轮状病毒的全基因序列或部分序列，尤其是抗原基因VP7基因和VP4基因。按照GenBank的序列设计引物，通过RT-PCR技术结合测序，获得了这几株轮状病毒的大部分序列，在结合Race技术获得其末端序列。权利要求1.通过分子流行病学研究获得亚洲罕见的轮状病毒为G5轮状病毒，使用MA104进行病毒分离，获得了病毒感染细胞情况，同时使用RT-PCR和RACE技术获得了这几株病毒的基因序列。2.表述1中的轮状病毒分离方法。3.表述1中病毒感染细包后的检测轮状病毒的活性的方法病毒滴度测定方法。4.表述1中的病毒全基因序列，以及编码抗原表位的VP7和VP4基因片段。5.表述1中病毒用于检测试剂的开发。6.表述一种病毒用于疫苗的开发。全文摘要A组轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿严重腹泻的最常见病原，在世界范围内流行，全球无论发达国家或发展中国家约90％的婴幼儿在3岁前都要受HRV感染。由于目前全世界流行的人轮状病毒株主要是G1、G2、G3和G9血清型。G5型轮状病毒最初是从猪的排泄物中分离到，随后在巴西、阿根廷等地检出。因此，这株G5轮状病毒的进一步进化是否非更适合感染人，成为人轮状病毒优势株，尤其是在轮状病毒疫苗大规模接种后，轮状病毒流行规律是否会发生改变。通过RT-PCR技术获得了该病毒的全序列。使用MA104细胞培养该病毒，获得了该病毒致细胞病变的电镜图片，使用半对数稀释法测定病毒半对数稀释法测定病毒滴度。文档编号A61K39/15GK102433309SQ20101029579公开日2012年5月2日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日专利技术者李丹地, 李金松, 段招军 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段招军，李丹地，李金松，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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