本发明专利技术公开了一种外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，能利用己知物种的公用数据库中的mRNA序列信息，找出基因外显子的5碱基寡聚核苷酸保守序列，以这个保守序列为核心，在其3’端连接6碱基随机序列构成11碱基序列，与5’端的固定序列共同组成20bp的引物。通过mRNA数据库初步筛选出11碱基序列出现频率较高的引物，再用PCR对其进行重复性筛选，得到作为基于FCR的外显子保守序列扩增多态性标记。本方法操作简便、有效、重复性好、减少引物筛选的时间和成本。这是遗传多样性分析的一种新的、有效的分子标记方法。可广泛应用于遗传图谱构建、基因或QTL定位、标记辅助育种、遗传多样性分析、基因组研究和mRNA表达差异分析等多种领域，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因组学、生物信息学领域，涉及外显子保守序列扩增多态性分子标记(Conserved sequence of exon amplified polymorphism, CSEAP)及其分析方法。
技术介绍
分子标记是以生物大分子(主要是遗传物质DNA)的多态性为基础的一种遗传标记，具有数量多、多态性高、不受季节、环境影响、检测手段简单迅速等多种优点。分子标记已经成为生命科学的前沿领域，广泛应用于生物遗传多样性分析、遗连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、亲缘关系分析、性别鉴定、基因组作图、基因克隆、文库构建和分子标记辅助选择育种等多个方面。自1980年首次提出分子标记的概念以来，分子标记的研究不断有相关的文献报道，特别是上世纪90年代以来，发展十分迅速。目前，可用于分子标记的方法超过十种，在植物的分子遗传研究中应用比较多的有DNA限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、随机扩增多态性 DNA(Random amplified polymorphism，RAPD)、简单重复序列(Simple Sequence R印eat，SSR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)和单核苷酸多态性(Sigle nucleotide polymorphisms, SNP)等，分子标记体系类型多样，应用广泛，但各自的技术复杂性、可靠性与提供的遗传信息丰富度不同。1980 年Botstein 等提出了 RFLP 分子标记技术(Botstein D, White R L, Skolnick Μ, Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics,1980,32 314-331)，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。该方法的基本原理为将基因组DNA用已知的限制性内切酶消化，电泳经Southern印迹后，用放射性同位素或非放射性物质标记探针，与转移于支持膜上的DNA杂交，经放射自显影显示出基因组DNA中与探针同源的DNA序列片段的大小。RFLP标记呈共显性，标记准确，不影响表型，数目也较多，但其分析程序复杂，有放射性污染，技术难度大，费时，成本较高，需要的DNA量较大，难以大范围推广应用。1990 年，Williams 等(Williams J G，Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A, Tingey S V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res,1990,18(22) :6531_6535)和 Welsh 等(Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer. Nucleic Acids Res, 1990,18 (24) :7213_7218)几乎同时将PCR技术应用于分子标记，发展出一种新型的分子标记技术RAPD，该方法是用短的(通常为IObp)随机序列DNA作为引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增而产生多态性。RAPD技术快速、简便、成本低廉。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷=RAPD为显性标记，不能提供完整的信息；易受实验条件影响；稳定性差；结果不能区分纯合体和杂合体。1989年Tautz提出了 SSR分子标记方法(Rautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source forpolymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, 1989，17 :6463_6471)，该方法是根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。SSR具有很好的稳定性和多态性，DNA 用量少，重复性高。但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证工作。1992年， Vos等人把RAPD和RFLP技术结合起来，专利技术了新的分子标记AFLP技术(Vos P, Hogers R， Bleeker M,Reijans M,van de Lee Τ, Hoernes Μ,Frijters A, Pot J, Peleman J, kuiper M,Zabeau M. AFLP :a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995, 23 =4407-4414)，该专利技术于1993年获欧洲专利局专利，专利号为EP0534858A1。该法先设计针对某种限制性内切酶的通用接头，以及可与接头序列和限制性酶切位点的序列配对的专用引物，用上述内切酶消化基因组DNA，将通用接头与限制性片段两端连接，再用专用引物扩增，最后电泳显示结果。AFLP具有标记多态性强、准确性高、重复性好以及可用于没有任何分子生物学研究基础的物种等优点，很快被推广到生物学的各个领域。但也存在明显的缺点技术繁琐、过程时间长、检测的不是等位片段、费用昂贵，且AFLP标记是显性标记， 不能提供完整信息。1996 年，Lander 提出了 SNP 技术(Lander E S. The new genomics Global views of biology. Science，1996，274 :536_539)，SNP 数量最为丰富，其遗传稳定性远高于SSR，可以进行快速、规模化筛查，易于基因分型，正成为一种极具应用潜力的新型分子标记。SNP既可以用PCR，又可以用DNA芯片来检测，但目前对SNP的检测在技术上还显得太复杂，难度较大，因而还难以广泛应用。近年来也发展了不少新的分子标记技术。主要有中国专利CN200410084499. 5，一种分子标记及其开发方法。该专利技术利用已完成测序的基因组及cDNA序列，将它们进行联配，得到每个基因的内含子数量及长度，对相应的内含子进行比较，从而得到两基因组间的长度差异的内含子，在该内含子两侧的外显子上或在其内部差异位点两侧的保守序列上设计引物，利用设计和引物和基因组序列进行电子 PCR，选择只有一个PCR产物的标记作为分子标记。中国专利CN 200710026739. X，一种基于功能基因多态性的分子标记方法。该方法是针对现有分子标记技术，尤其是TRAP和SNP标记技术的不足之处，利用已知物种的公用数据库中的gDNA、cDNA或EST序列信息，设计不同基因的特异引物和高频序列引物并配合其相应的退火温度，作为基于PCR的功能基因扩增多态性标记方法。中国专利C本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何龙飞，何海旺，许春燕，李创珍，韦善清，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。